Mae PCR meintiol fflworoleuedd (a elwir hefyd yn TaqMan PCR, y cyfeirir ati yma wedi hyn fel FQ-PCR) yn dechnoleg feintiol asid niwclëig newydd a ddatblygwyd gan PE (Perkin Elmer) yn yr Unol Daleithiau ym 1995. Mae'r dechnoleg hon yn seiliedig ar PCR confensiynol trwy ychwanegu chwiliedyddion wedi'u labelu fflwroleuol.O'i gymharu â PCR hyblyg, mae gan FQ-PCR lawer o fanteision i wireddu ei swyddogaeth feintiol.Bwriad yr erthygl hon yw disgrifio'n fyr nodweddion, egwyddorion, dulliau a chymwysiadau'r dechnoleg.
1 Nodweddion
Mae gan FQ-PCR nid yn unig sensitifrwydd uchel PCR cyffredin, ond hefyd oherwydd cymhwyso stilwyr fflwroleuol, gall ganfod yn uniongyrchol newid signal fflwroleuol yn ystod ymhelaethu PCR trwy'r system dargludiad ffotodrydanol i gael canlyniadau meintiol, sy'n goresgyn llawer o ddiffygion PCR confensiynol, felly mae ganddo hefyd benodolrwydd uchel hybridization DNA a chywirdeb uchel technoleg sbectrosgopeg.
Er enghraifft, mae angen arsylwi cynhyrchion PCR cyffredinol gan electrofforesis gel agarose a staenio bromid ethidium gyda golau uwchfioled neu gan electrofforesis gel polyacrylamid a staenio arian.Mae hyn nid yn unig yn gofyn am offerynnau lluosog, ond hefyd yn cymryd amser ac ymdrech.Y staeniau a ddefnyddir Mae bromid Ethidium yn niweidiol i'r corff dynol, ac mae'r gweithdrefnau arbrofol cymhleth hyn yn darparu cyfleoedd ar gyfer llygredd a phethau cadarnhaol ffug.Fodd bynnag, dim ond unwaith y mae angen i FQ-PCR agor y caead yn ystod llwytho sampl, ac mae'r broses ddilynol yn weithrediad tiwb cwbl gaeedig, nad oes angen ôl-brosesu PCR arno, gan osgoi llawer o anfanteision mewn gweithrediadau PCR confensiynol.Yn gyffredinol, mae'r arbrawf yn defnyddio'r seiclwr thermol ABI7100 PCR a ddatblygwyd gan gwmni Addysg Gorfforol.
Mae gan yr offeryn y nodweddion canlynol: ① Cymhwysiad eang: Gellir ei ddefnyddio ar gyfer meintioli cynnyrch DNA a RNA PCR, ymchwil mynegiant genynnau, canfod pathogenau, ac optimeiddio amodau PCR.② Egwyddor feintiol unigryw: Gan ddefnyddio chwiliedyddion wedi'u labelu'n fflwroleuol, bydd swm y fflworoleuedd yn cronni gyda'r cylch PCR ar ôl cyffro laser, er mwyn cyflawni pwrpas meintioli.③ Effeithlonrwydd gweithio uchel: Beiciwr thermol 9600 PCR wedi'i gynnwys, 1 i 2 awr wedi'i reoli gan gyfrifiadur i gwblhau ymhelaethu a meintioli 96 o samplau yn awtomatig ac yn gydamserol.④ Dim angen electrofforesis gel: Nid oes angen gwanhau ac electrofforesis y sampl, dim ond defnyddio stiliwr arbennig i ganfod yn uniongyrchol yn y tiwb adwaith.⑤Dim llygredd ar y gweill: Mae'r tiwb adwaith cwbl gaeedig unigryw a'r system dargludiad ffotodrydanol yn cael eu mabwysiadu, felly nid oes angen poeni am lygredd.⑥ Mae'r canlyniadau'n atgynhyrchadwy: mae'r amrediad deinamig meintiol hyd at bum gorchymyn maint.Felly, ers i'r dechnoleg hon gael ei datblygu'n llwyddiannus, mae llawer o ymchwilwyr gwyddonol wedi'i gwerthfawrogi ac fe'i cymhwyswyd mewn sawl maes.
2 Egwyddorion a dulliau
Egwyddor weithredol FQ-PCR yw defnyddio gweithgaredd exonuclease 5′→3′ o ensym Taq i ychwanegu stiliwr wedi'i labelu'n fflworoleuol i'r system adwaith PCR.Gall y stiliwr groesi'n benodol â'r templed DNA sydd yn y dilyniant preimio.Mae diwedd 5′ y stiliwr wedi'i labelu â'r genyn allyrru fflworoleuedd FAM (6-carboxyfluorescein, brig allyriadau fflworoleuedd yn 518nm), ac mae'r pen 3′ wedi'i labelu â'r grŵp diffodd fflworoleuedd TAMRA (6-carboxytetrabetramethylrhodamine, fflworoleuedd ′ 3 uchaf allyriad ffotoeseniad) phorylated i atal y stiliwr rhag cael ei ymestyn yn ystod ymhelaethu PCR.Pan fydd y stiliwr yn dal yn gyfan, mae'r grŵp diffoddwr yn atal allyriad fflworoleuedd y grŵp allyrru.Unwaith y bydd y grŵp allyrru wedi'i wahanu oddi wrth y grŵp diffodd, mae'r ataliad yn cael ei godi, ac mae'r dwysedd optegol ar 518nm yn cynyddu ac yn cael ei ganfod gan y system canfod fflworoleuedd.Yn y cyfnod ailnatureiddio, mae'r chwiliedydd yn hybridizes gyda'r templed DNA, ac mae'r ensym Taq yn y cyfnod ymestyn yn symud ar hyd y templed DNA gydag estyniad y paent preimio.Pan fydd y stiliwr yn cael ei dorri i ffwrdd, mae'r effaith diffodd yn cael ei ryddhau a'r signal fflwroleuol yn cael ei ryddhau.Bob tro y bydd y templed yn cael ei gopïo, caiff stiliwr ei dorri i ffwrdd, ynghyd â rhyddhau signal fflwroleuol.Gan fod perthynas un-i-un rhwng nifer y fflworofforau a ryddhawyd a nifer y cynhyrchion PCR, gellir defnyddio'r dechneg hon i feintioli'r templed yn gywir.Yn gyffredinol, mae'r offeryn arbrofol yn defnyddio'r seiclwr thermol ABI7100 PCR a ddatblygwyd gan gwmni AG, a gellir defnyddio beicwyr thermol eraill hefyd.Os defnyddir system adwaith math adwaith ABI7700 ar gyfer yr arbrawf, ar ôl i'r adwaith gael ei gwblhau, gellir rhoi'r canlyniadau meintiol yn uniongyrchol trwy ddadansoddiad cyfrifiadurol.Os ydych chi'n defnyddio beicwyr thermol eraill, mae angen i chi ddefnyddio synhwyrydd fflworoleuedd i fesur y signal fflworoleuedd yn y tiwb adwaith ar yr un pryd i gyfrifo RQ+, RQ-, △RQ.Mae RQ+ yn cynrychioli cymhareb dwyster goleuedd grŵp allyriadau fflwroleuol y tiwb sampl i ddwysedd goleuedd y grŵp diffodd, mae RQ- yn cynrychioli cymhareb y ddau yn y tiwb gwag, mae △RQ (△RQ=RQ=RQ+-RQ-) yn cynrychioli faint o newid signal fflworoleuedd yn ystod PCR Ar ôl prosesu data, gellir ei ganfod yn feintiol.Oherwydd cyflwyno stilwyr fflwroleuol, mae penodoldeb yr arbrawf wedi gwella'n sylweddol.Yn gyffredinol, dylai dyluniad y stiliwr fodloni'r amodau canlynol: ① Dylai hyd y stiliwr fod tua 20-40 sylfaen i sicrhau penodoldeb y rhwymiad.② Mae cynnwys seiliau GC rhwng 40% a 60% er mwyn osgoi dyblygu dilyniannau niwcleotid sengl.③ Osgoi croesrywio neu orgyffwrdd â paent preimio.④ Mae sefydlogrwydd y rhwymiad rhwng y stiliwr a'r templed yn fwy na sefydlogrwydd y rhwymiad rhwng y paent preimio a'r templed, felly dylai gwerth Tm y stiliwr fod o leiaf 5 ° C yn uwch na gwerth Tm y paent preimio.Yn ogystal, mae crynodiad y stiliwr, y homoleg rhwng y stiliwr a'r dilyniant templed, a'r pellter rhwng y stiliwr a'r paent preimio i gyd yn effeithio ar y canlyniadau arbrofol.
Cynhyrchion cysylltiedig:
Tsieina Amser Real PCR Easyᵀᴹ-Taqman Gwneuthurwr a Chyflenwr |Foregene (foreivd.com)
Amser postio: Hydref-15-2021
