• facebook
  • yn gysylltiedig
  • youtube

1. Canfod amsugnedd hydoddiant RNA

Mae amsugnedd ar 280, 320, 230, a 260 nm yn cynrychioli gwerthoedd asid niwclëig, cefndir (cymylogrwydd datrysiad), crynodiad halen, a mater organig fel protein, yn y drefn honno.Yn gyffredinol dim ond edrych ar OD260/OD280 (cymhareb, R).Pan fydd 1.8 ~ 2.0, credwn y gellir goddef halogiad protein neu ddeunydd organig arall mewn RNA, ond dylid nodi pan ddefnyddir Tris fel byffer i ganfod yr amsugnedd, gall y gwerth R fod yn fwy na 2 (yn gyffredinol dylai fod <2.2).Pan fydd R <1.8, mae llygredd protein neu fater organig arall yn yr hydoddiant yn fwy amlwg, a gellir pennu tynged yr RNA yn ôl yr anghenion.Pan fydd R>2.2, mae'n golygu bod RNA wedi'i hydrolysu i asid niwclëig sengl.
 
Patrwm 2.Electrophoretic o RNA
Yn gyffredinol, defnyddir gel dadnatureiddio ar gyfer electrofforesis RNA, ond os mai dim ond ar gyfer canfod ansawdd RNA ydyw, nid oes angen gel dadnatureiddio, a gellir defnyddio gel agarose cyffredin.Pwrpas electrofforesis yw canfod uniondeb bandiau 28S a 18S a'u cymhareb, neu gyfanrwydd ceg y groth mRNA.Yn gyffredinol, os yw'r bandiau 28S a 18S yn llachar, yn glir, ac yn sydyn (gan gyfeirio at ymylon y bandiau yn glir), a bod disgleirdeb 28S yn fwy na dwywaith yn fwy na'r band 18S, rydym yn ystyried bod ansawdd yr RNA yn dda.
Yr uchod yw'r ddau ddull a ddefnyddiwn yn gyffredin, ond ni all yr un o'r ddau ddull hyn ddweud yn glir wrthym a oes RNase gweddilliol yn y datrysiad RNA.Os oes ychydig iawn o RNase yn yr ateb, mae'n anodd i ni ei ganfod gyda'r dull uchod, ond mae'r rhan fwyaf o'r adweithiau ensymatig dilynol yn cael eu cynnal ar dymheredd uwch na 37 gradd ac am amser hir.Yn y modd hwn, os oes ychydig iawn o RNase yn yr ateb RNA, yna bydd amgylchedd ac amser addas iawn i chwarae eu rhan yn yr arbrofion dilynol, ac wrth gwrs bydd yr arbrawf yn oer ar hyn o bryd.Isod rydym yn cyflwyno dull a all gadarnhau a oes RNase gweddilliol yn y datrysiad RNA.
 
3. Prawf cadw gwres
Yn ôl crynodiad y sampl, tynnwch ddau RNA 1000 ng o'r hydoddiant RNA a'i ychwanegu at diwb centrifuge 0.5 ml, a'i ychwanegu â byffer pH 7.0 Tris i gyfanswm cyfaint o 10 ul, ac yna selio cap y tiwb.Rhowch un ohonynt mewn baddon dŵr tymheredd cyson ar 70 ° C a'i gadw'n gynnes am 1 h.Storiwyd y rhan arall mewn oergell -20 ° C am 1 h.Pan ddaw'r amser i ben, tynnwch y ddau sampl ar gyfer electrofforesis.Ar ôl i'r electrofforesis gael ei gwblhau, cymharwch fandiau electrofforetig y ddau.Os yw bandiau'r ddau yn gyson neu nad oes ganddynt unrhyw wahaniaeth arwyddocaol (wrth gwrs, mae eu bandiau hefyd yn bodloni'r amodau yn y dull 2), mae'n golygu nad oes unrhyw halogiad RNase gweddilliol yn y datrysiad RNA, ac mae ansawdd yr RNA yn dda iawn.I'r gwrthwyneb, os yw'r sampl a ddeorwyd ar 70 ° C yn dangos diraddiad amlwg, mae'n dangos bod halogiad RNase yn yr hydoddiant RNA.
 
2 Dulliau a thechnegau arbrofol ar gyfer echdynnu RNA
Y problemau rydym yn dod ar eu traws yn aml wrth echdynnu RNA yw: (1) Mae cynnyrch RNA yn isel;(2) Mae gan RNA lygredd halen difrifol;(3) Mae gan RNA lygredd toddyddion organig difrifol;(4) diraddio sampl a phroblemau eraill
 
1. adweithyddion echdynnu RNA cyfanswm a ddefnyddir yn gyffredin
Y dull guanidine isothiocyanate a'r dull Trizol yw'r dulliau a ddefnyddir amlaf ar gyfer echdynnu cyfanswm RNA o feinweoedd anifeiliaid a chelloedd anifeiliaid.Mae'n arbennig o addas ar gyfer samplau bach a meinweoedd sy'n arbennig o anodd eu tynnu, megis echdynnu cyfanswm RNA o groen cwningen a meinwe gyswllt anifeiliaid;yn ogystal, gellir defnyddio Trizol, fel adweithydd lysis pwrpas cyffredinol, hefyd ar gyfer echdynnu meinweoedd planhigion, bacteria, ffyngau a meinweoedd eraill.Ar gyfer meinweoedd planhigion sy'n cynnwys polysacaridau a polyphenolau, megis camellia oleifera, dail te, had rêp, ac ati, gellir defnyddio'r dull CTAB hefyd i echdynnu cyfanswm RNA.

Fel dull confensiynol, mae'r dull colofn dwbl hefyd yn boblogaidd iawn oherwydd ei weithrediad tymheredd arferol, nid oes angen ychwanegu RNase, a diogelwch - dim clorofform, ffenolau ac adweithyddion organig eraill i'w echdynnu.(cynhyrchion a argymhellir )

1
2

2. Echdynnu cyfanswm RNA o feinweoedd anifeiliaid
 
(1) Ceisiwch ddewis meinwe ffres, os nad yw'n ffres (yn ddelfrydol o fewn tri mis - 80 ℃ oergell neu wedi'i rewi mewn nitrogen hylifol. Wrth dorri meinwe, peidiwch â thorri'n uniongyrchol ar dymheredd yr ystafell, gwnewch yn siŵr ei roi ar y blwch iâ, ceisiwch osgoi rhewi a dadmer dro ar ôl tro.
(2) Defnyddiwch siswrn glân a phliciwr i dorri darn bach o feinwe, ceisiwch dorri rhan ganolog y meinwe wrth dorri'r sampl, neu dorri'r darn mawr o feinwe o'r canol yn gyntaf, ac yna torrwch y sampl yn y safle toriad ffres.Dylai'r meinwe wedi'i dynnu gael ei rwygo'n llwyr, rhowch y meinwe wedi'i rwygo i mewn i tiwb EP heb RNase, ychwanegwch y lysate, dylai'r meinwe wedi'i dorri fod yn agored i'r lysate yn llawn, a pharatoi ar gyfer homogenization.

(3) Ar gyfer meinweoedd arferol, dewiswch feinweoedd maint ffa mung (30-60 mg) ar gyfer homogenization.Os yw'r meinweoedd yn cynnwys llawer iawn o brotein, braster, neu feinweoedd ffibrog trwchus fel yr afu, cynyddwch neu lleihewch faint o feinweoedd sydd wedi'u torri (dewisol) Dewiswch 10 ~ 20 mg).
(4) Os caiff cyhyrau pysgod, cig berdys, slefrod môr a meinweoedd eraill â chynnwys dŵr uchel eu tynnu, dylid cynyddu cyfaint y sampl yn briodol (argymhellir 100-200 mg).
(5) Os yw amodau'n caniatáu, gellir echdynnu'r meinwe anifail yn uniongyrchol ar ôl cael ei homogeneiddio â homogenizer meinwe uchel-pas, os nad oes offer o'r fath.
(6) Rhaid gosod yr RNA a geir ar ôl yr echdyniad terfynol ar y blwch iâ ar unwaith i leihau diraddiad RNA.

3. Echdynnu RNA cell anifeiliaid

(1) Celloedd atal: centrifuge yn uniongyrchol a thaflu'r cyfrwng, golchi â PBS di-haint am 1-2 gwaith, yna atal gyda swm priodol o PBS, ac yna ychwanegu lysate ar gyfer lysis.Peidiwch ag ychwanegu'r lysate yn uniongyrchol i'r celloedd gwaddod ar ôl taflu'r hylif yn llwyr.Bydd hyn yn achosi i'r pecyn histone a ryddheir ar ôl i'r celloedd lysed ar yr haen allanol gadw at y tu allan i'r celloedd gwaddod, a thrwy hynny gyfyngu ar gyswllt y celloedd y tu mewn i'r belen â'r lysate., gan arwain at lysis celloedd anghyflawn a llai o gynnyrch RNA.

(2) Celloedd sy'n lled-ymlynol neu nad ydynt yn glynu'n dynn: Ar ôl taflu'r cyfrwng, golchwch â PBS am 1-2 gwaith, yna amsugno'n uniongyrchol swm priodol o PBS a chwythwch y ddysgl diwylliant gyda phibed neu gwn i chwythu'r celloedd i ffwrdd, a'u trosglwyddo i gelloedd di-RNA.Ychwanegwch y lysate i diwb EP yr ensym ar gyfer echdynnu.

(3) Celloedd ymlynol: mae angen eu treulio â trypsin yn gyntaf, yna eu casglu i mewn i diwbiau EP di-RNase, eu centrifugio i gael gwared ar y supernatant, golchi 1-2 gwaith gyda PBS i gael gwared ar trypsin gormodol, a'i ail-ddarparu gyda swm priodol o PBS Yna symud ymlaen i'r cam echdynnu.

4. Echdynnu RNA planhigion

Mae meinweoedd planhigion yn gyfoethog mewn cyfansoddion ffenolig, neu'n gyfoethog mewn polysacaridau, neu'n cynnwys rhai metabolion eilaidd anhysbys, neu mae ganddynt weithgaredd uchel o RNase.Mae'r sylweddau hyn wedi'u cyfuno'n dynn ag RNA ar ôl lysis celloedd i ffurfio cyfadeiladau anhydawdd neu waddodion colloidal, sy'n anodd eu tynnu.Felly, pan fyddwn yn echdynnu meinwe planhigion, mae angen inni ddewis pecyn ar gyfer planhigion.Gall y lysate yn y pecyn ddatrys problemau ocsidiad hawdd polyffenolau a gwahanu cyfansoddion polysacarid ac asidau niwclëig yn effeithiol.

(Ar gyfer echdynnu RNA planhigion polyphenol polysacarid, cynhyrchion a argymhellir:

(1) Dylai croen, mwydion, hadau, dail, ac ati y planhigyn gael ei falu'n llawn mewn morter.Yn ystod y broses malu, dylid ailgyflenwi nitrogen hylifol mewn pryd i osgoi toddi'r sampl.Dylid ychwanegu'r sampl ddaear yn gyflym at y lysate a'i ysgwyd i osgoi diraddio RNA.

(2) Ar gyfer samplau sy'n llawn ffibr fel dail reis a gwenith, dylid lleihau faint o echdynnu'n briodol, fel arall ni fydd y malu meinwe a'r lysis yn gyflawn, gan arwain at gynnyrch isel o RNA wedi'i dynnu.

(3) Ar gyfer meinweoedd planhigion â chynnwys dŵr uchel, megis ffrwythau pomegranad, ffrwythau watermelon, ffrwythau eirin gwlanog, ac ati, dylid cynyddu maint y sampl yn briodol (mae 100-200 mg yn ddewisol).

(4) Yn gyffredinol, mae meinweoedd planhigion, megis dail planhigion, rhisomau, ffrwythau caled a deunyddiau eraill yn cael eu hargymell i ddefnyddio nitrogen hylifol i roi'r cynhwysion mewn morter yn drylwyr, ac yna symud ymlaen i'r cam echdynnu.Efallai na fydd homogenizers meinwe confensiynol yn effeithiol wrth homogeneiddio meinweoedd planhigion, ac yn gyffredinol ni chânt eu hargymell.

5. Rhagofalon ar gyfer echdynnu RNA

(1) Dylai samplau meinwe fod mor ffres â phosibl er mwyn osgoi rhewi a dadmer dro ar ôl tro.

(2) Dylai'r meinwe fod yn ddaear yn llawn yn ystod echdynnu, ac ni ddylai maint y meinwe fod yn rhy ychydig, heb sôn am ormod.

(3) Dylid rhoi digon o amser deori ar ôl ychwanegu'r lysate i lyse'r sampl yn llawn.

(4) Wrth ddefnyddio'r dull Trizol ar gyfer echdynnu, yr egwyddor o amsugno'r supernatant ar ôl haenu yw "gwell anadlu llai nag anadlu mwy", ac ni ddylai echdynnu i'r haen ganol, fel arall bydd yn achosi halogiad DNA genomig difrifol.

(5) Wrth olchi, dylai'r hylif golchi ymdreiddio'n llawn o amgylch wal y tiwb i sicrhau golchi trylwyr.

(6) Ar gyfer y dull echdynnu colofn, yn ogystal â datgysylltu'r golofn ar ôl golchi, dylid gosod y golofn arsugniad hefyd mewn mainc uwch-lân a'i chwythu am 5-10 munud i anweddu'r toddydd organig yn llawn i sychder.

(7) Ar elution olaf y dull colofn, ar ôl ychwanegu dŵr DEPC, dylid ei ddeor am 3-5 munud, neu dylid cynhesu'r dŵr DEPC i 60 ° C ymlaen llaw i gynyddu'r cynnyrch elution.Yn y dull traddodiadol o holltiad Trizol a dyddodiad isopropanol, mae'r RNA terfynol yn cael ei hydoddi mewn dŵr DEPC, felly dylid rhoi amser priodol ar gyfer diddymu, a dylai gwaelod y tiwb centrifuge gael ei chwythu'n barhaus gyda blaen pibed.

3 Three Achosion ac atebion ar gyfer crynodiad RNA isel/ansawdd gwael
 
1. Mae'r cynnyrch yn rhy isel
Mae'r sampl wedi'i dynnu yn rhy isel, mae'r cyfanswm yn annigonol, neu mae'r sampl wedi'i dynnu yn ormod ac nid yw'r lysis yn gyflawn;dylid defnyddio'r meinwe neu'r celloedd o ansawdd priodol ar gyfer echdynnu, rhaid i'r rhag-driniaeth o'r sampl gael ei wneud yn dda, a dylai'r lysis fod yn ddigonol.
 
2. Gweddillion genom
Wrth echdynnu trwy ddull Trizol, pan fydd y supernatant yn cael ei sugno i'r haen ganol ar ôl ei haenu, bydd halogiad genom difrifol yn cael ei achosi;dylid cymryd gofal ychwanegol wrth haenu i osgoi sugno i'r haen ganol.Os defnyddir y dull colofn ar gyfer echdynnu, gellir dewis pecyn sy'n cynnwys DNase I i'w echdynnu.Mae'r asid niwclëig sydd wedi'i arsugno ar y bilen yn cael ei dreulio'n uniongyrchol â DNase I, a all leihau'r gweddillion DNA yn fawr.
 
3. Diraddio RNA
Gall fod yn ddiraddio'r sampl a echdynnwyd ei hun, neu'r diraddio a achosir yn ystod y broses echdynnu;cyn belled ag y bo modd, dylid defnyddio samplau ffres ar gyfer echdynnu RNA, a dylid storio'r samplau a gasglwyd mewn oergell nitrogen hylifol neu -80 ° C mewn pryd, a dylid osgoi rhewi a dadmer dro ar ôl tro.Dylid defnyddio awgrymiadau di-RNase/DNase, tiwbiau centrifuge a deunyddiau eraill yn y broses echdynnu RNA.Dylai'r broses echdynnu fod mor gyflym â phosibl.Dylid gosod yr RNA wedi'i dynnu ar flwch iâ a'i storio ar -80 mewn amser.Os oes angen canfod yr RNA wedi'i dynnu gan electrofforesis gel, dylid perfformio electrofforesis yn syth ar ôl echdynnu, a dylid disodli'r byffer electrofforesis gydag un sydd newydd ei baratoi.
 
4. Halen a gweddillion toddyddion organig
Mae'r adweithyddion echdynnu yn cynnwys halwynau ffenol a guanidine, ac mae'r toddiant golchi yn cynnwys ethanol.Yn ystod y broses echdynnu, ni chafodd y lysate ei amsugno'n llwyr a'i daflu, ac ni chafodd yr ateb golchi ei sychu'n llawn.Mae halwynau gweddilliol a thoddyddion organig yn niweidiol i drawsgrifio gwrthdro dilynol a PCR.Gwahanol raddau o ataliad, felly dylid tynnu'r lysate meinwe yn llawn yn ystod y broses echdynnu, a dylai'r golchi fod yn ddigonol fel y gellir golchi waliau amgylchynol y tiwb.Yn ogystal, mae'r tiwb yn cael ei wagio a'i chwythu yn gam angenrheidiol, a fydd yn lleihau'r gweddillion mater organig ymhellach.
 
I gael rhagor o wybodaeth am echdynnu RNA, dilynwch ein gwefan:
www.foreivd.com am fwy o wybodaeth.

7

Amser postio: Rhagfyr-01-2022