PCR yw'r dechnoleg ymhelaethu asid niwclëig a ddefnyddir fwyaf ac fe'i defnyddir yn helaeth oherwydd ei sensitifrwydd a'i benodolrwydd.Fodd bynnag, mae PCR yn gofyn am ddadnatureiddio thermol dro ar ôl tro ac ni all gael gwared ar gyfyngiadau dibynnu ar offer ac offer, sy'n cyfyngu ar ei gymhwysiad mewn profion maes clinigol.

Ers y 1990au cynnar, mae llawer o labordai wedi dechrau datblygu technoleg chwyddo tymheredd cyson nad oes angen dadnatureiddio thermol.Bellach maent wedi datblygu technoleg mwyhau isothermol drwy gyfrwng dolen, technoleg mwyhau isothermol amnewid llinyn, technoleg mwyhau isothermol cylch treigl, a dibyniaeth ar ddilyniant asid niwclëig.Technoleg mwyhau isothermol a thechnolegau eraill. 

Lymhelaethu isothermol oop-mediated

Mae egwyddor ymhelaethu yn seiliedig ar y ffaith bod DNA mewn cyflwr ecwilibriwm deinamig ar tua 65°C.Pan fydd unrhyw preimiwr wedi'i baru â basau a'i ymestyn i'r rhan gyflenwol o DNA llinyn dwbl, bydd y llinyn arall yn daduno ac yn dod yn un edefyn.

Ar y tymheredd hwn, mae DNA yn defnyddio 4 preimiwr penodol i ddibynnu ar bolymeras DNA dadleoliad llinyn i wneud i'r synthesis o DNA dadleoli llinynnau hunan-gylchredeg yn barhaus.

Yn gyntaf, pennwch y 6 rhanbarth penodol F3, F2, F1, B1, B2, B3 ar y genyn targed, ac yna dyluniwch 4 preimiwr yn seiliedig ar y 6 rhanbarth penodol hyn (fel y dangosir yn y ffigur isod):

Mae'r preimiwr mewnol ymlaen (FIP) yn cynnwys F1c a F2.

Mae'r paent preimio mewnol yn ôl (BIP) yn cynnwys B1c a B2, a defnyddir TTTT fel gofodwr yn y canol.

Mae'r preimwyr allanol F3 a B3 yn y drefn honno yn cynnwys rhanbarthau F3 a B3 ar y genyn targed.

Yn y system adwaith LAMP, mae crynodiad y paent preimio mewnol sawl gwaith yn fwy na'r paent preimio allanol.Mae'r paent preimio mewnol yn cael ei gyfuno'n gyntaf â'r llinyn templed i syntheseiddio llinyn cyflenwol i ffurfio llinyn dwbl DNA.Yn dilyn hynny, mae'r paent preimio allanol yn cael ei gyfuno â'r llinyn templed i ffurfio llinyn dwbl DNA.O dan weithred BstDNA polymeras, mae'r llinyn cyflenwol wedi'i syntheseiddio gan y paent preimio mewnol yn cael ei ryddhau.Ar ôl cyfres o adweithiau, mae'r llinyn cyflenwol o'r diwedd yn ffurfio un llinyn DNA gyda strwythur dumbbell.

Mae'r strwythur dumbbell DNA llinyn sengl ei hun yn cael ei ddefnyddio fel templed i ffurfio'n barhaus strwythur trosiannol coesyn-dolen DNA gyda phen agored.Mae'r paent preimio mewnol ac allanol yn llywio'r strwythur dolen goes trosiannol DNA i ddadleoli llinynnau ac adweithiau estyn yn barhaus, ac yn olaf ffurfio strwythurau dolen bonyn lluosog gyda hydoedd gwahanol.cymysgedd DNA.

Manteision ac anfanteision mwyhau isothermol trwy gyfrwng dolen

Manteision LAMP:

(1) Effeithlonrwydd ymhelaethu uchel, a all ehangu 1-10 copi o'r genyn targed yn effeithiol o fewn 1h, ac mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu 10-100 gwaith yn fwy na PCR cyffredin.

(2) Mae'r amser adwaith yn fyr, mae'r penodoldeb yn gryf, ac nid oes angen offer arbennig.

Diffygion LAMP:

(1) Mae'r gofynion ar gyfer paent preimio yn arbennig o uchel.

(2) Ni ellir defnyddio'r cynnyrch chwyddedig ar gyfer clonio a dilyniannu, ond dim ond ar gyfer barn y gellir ei ddefnyddio.

(3) Oherwydd ei sensitifrwydd cryf, mae'n hawdd ffurfio aerosolau, gan achosi positifau ffug ac effeithio ar ganlyniadau'r profion.

Symhelaethiad dadleoli traddodiadol

Mae mwyhau dadleoli llinyn (SDA) yn dechneg ymhelaethu DNA isothermol in vitro yn seiliedig ar adwaith ensymatig a gynigiwyd gyntaf gan yr ysgolhaig Americanaidd Walker ym 1992.

Mae system sylfaenol SDA yn cynnwys endonuclease cyfyngu, polymeras DNA gyda gweithgaredd dadleoli llinyn, dau bâr o preimwyr, dNTPs, ac ïonau calsiwm a magnesiwm a systemau byffer.

Mae egwyddor ymhelaethu ar ddadleoli llinynnau yn seiliedig ar y dilyniant adnabod endonuclease cyfyngiad a addaswyd yn gemegol ar ddau ben y DNA targed.Mae'r endonuclease yn agor y bwlch yn y llinyn DNA yn ei safle adnabod, ac mae'r DNA polymeras yn ymestyn y bwlch 3′ Diwedd ac yn disodli'r llinyn DNA nesaf.

Gellir cyfuno'r llinynnau sengl o DNA sydd wedi'u disodli â phremwyr a'u hymestyn yn llinynnau dwbl gan DNA polymeras.Mae'r broses hon yn cael ei hailadrodd yn barhaus, fel bod y dilyniant targed yn cael ei chwyddo'n effeithlon.

Manteision ac anfanteision technoleg ymhelaethu ar ddadleoli llinynnau

Manteision SDA:

Mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn uchel, mae'r amser adwaith yn fyr, mae'r penodoldeb yn gryf, ac nid oes angen offer arbennig.

Diffygion SDA:

Nid yw'r cynhyrchion yn unffurf, ac mae rhai cynhyrchion un-sownd a dwbl bob amser yn cael eu cynhyrchu yn y cylch SDA, ac mae'n anochel y bydd cynffon yn digwydd pan gaiff ei ganfod gan electrofforesis.

Rymhelaethiad cylch oling

Cynigir ymhelaethu ar gylchoedd rholio (RCA) trwy dynnu ar y dull o gopïo DNA o organebau pathogenig trwy gylchrediad.Mae'n cyfeirio at y defnydd o DNA crwn un edefyn fel templed ar dymheredd cyson, a DNA polymeras arbennig (fel Phi29) ) O dan weithred synthesis DNA cylch treigl i gyflawni ymhelaethu ar y genyn targed.

Gellir rhannu RCA yn ymhelaethiad llinol ac ymhelaethu esbonyddol.Gall effeithlonrwydd RCA llinol gyrraedd 10⁵amseroedd, a gall effeithlonrwydd RCA esbonyddol gyrraedd 10⁹amseroedd.

Gwahaniaethu syml, fel y dangosir yn y ffigur isod, dim ond 1 paent preimio y mae mwyhad llinol a yn ei ddefnyddio, mae gan fwyhad esbonyddol b 2 primer.

Gelwir RCA llinol hefyd yn RCA paent preimio sengl.Mae paent preimio yn clymu i DNA crwn ac yn cael ei ymestyn gan weithred DNA polymeras.Mae'r cynnyrch yn llinyn sengl llinol gyda nifer fawr o ddilyniannau ailadroddus filoedd o weithiau hyd un ddolen.

Gan fod cynnyrch RCA llinol bob amser wedi'i gysylltu â'r paent preimio cychwynnol, mae gosodiad hawdd y signal yn fantais fawr.

RCA esbonyddol, a elwir hefyd yn ymhelaethu canghennog Hyper HRCA (RCA canghennog Hyper), yn RCA esbonyddol, mae un paent preimio yn ymhelaethu ar y cynnyrch RCA, mae'r ail primer yn hybridizes â'r cynnyrch RCA ac yn ymestyn, ac mae'r ailosodiad eisoes yn rhwym i'r cynnyrch RCA.

Manteision ac anfanteision ymhelaethiad asid niwclëig cylch treigl

Manteision RCA:

Sensitifrwydd uchel, penodoldeb da a gweithrediad hawdd.

Diffygion RCA:

Problemau cefndir wrth ganfod signal.Yn ystod yr adwaith RCA, gall y stiliwr clo clap heb ei gylchredeg a'r templed DNA neu RNA y stiliwr heb ei rwymo gynhyrchu rhai signalau cefndir. 

Nymhelaethu ar ddilyniant wclicasid

Mae mwyhau asid niwclëig ar sail dilyniant (NASBA) yn dechnoleg newydd a ddatblygwyd ar sail PCR.Mae'n fwyhad asid niwclëig parhaus ac isothermol wedi'i arwain gan bâr o preimwyr gyda dilyniant hyrwyddwr T7.Gall y dechnoleg ymhelaethu ar y templed RNA tua 109 gwaith mewn tua 2 awr, sydd 1000 gwaith yn uwch na'r dull PCR confensiynol ac nid oes angen offer arbennig arno.

Defnyddiwyd y dechnoleg hon ar gyfer diagnosis cyflym o glefydau cyn gynted ag yr ymddangosodd, ac ar hyn o bryd mae llawer o gwmnïau'n defnyddio'r dull hwn mewn pecynnau canfod RNA.

Er y gall ymhelaethu RNA hefyd ddefnyddio technoleg PCR trawsgrifio gwrthdro, mae gan NASBA ei fanteision ei hun: gellir ei gynnal o dan amodau tymheredd cymharol gyson, ac mae'n fwy sefydlog a chywir na thechnoleg PCR traddodiadol.

Mae'r adwaith ar 41 gradd Celsius ac mae angen AMV (firws myeloblastosis adar) trawsgrifiad gwrthdro, RNase H, T7 RNA polymeras a phâr o preimwyr i'w cwblhau.

Mae'r broses yn bennaf yn cynnwys:

Mae'r preimiwr ymlaen yn cynnwys dilyniant cyflenwol yr hyrwyddwr T7.Yn ystod yr adwaith, mae'r preimiwr ymlaen yn clymu i'r llinyn RNA ac yn cael ei gataleiddio gan yr ensym AMV i ffurfio llinyn dwbl DNA-RNA.

Mae RNase H yn treulio'r RNA yn y llinyn dwbl hybrid ac yn cadw'r DNA un llinyn.

O dan weithred y preimiwr gwrthdro a'r ensym AMV, mae llinyn dwbl DNA sy'n cynnwys y dilyniant hyrwyddwr T7 yn cael ei ffurfio.

O dan weithred T7 RNA polymeras, cwblheir y broses drawsgrifio a chynhyrchir llawer iawn o RNA targed.

Manteision NASBA:

(1) Mae gan ei primer ddilyniant hyrwyddwr T7, ond nid oes gan y DNA llinyn dwbl tramor unrhyw ddilyniant hyrwyddwr T7 ac ni ellir ei ymhelaethu, felly mae gan y dechnoleg hon benodolrwydd a sensitifrwydd uchel.

(2) Mae NASBA yn ymgorffori'r broses trawsgrifio gwrthdro yn uniongyrchol yn yr adwaith mwyhau, gan fyrhau'r amser adwaith.

Anfanteision NASBA:

(1) Mae cydrannau'r adwaith yn fwy cymhleth.

(2) Mae angen tri math o ensymau i wneud yr adwaith yn costio'n uwch.