Fel un newydd yn y labordy, nid yw'n waith da sgrinio planhigion positif allan o griw o blanhigion sydd â chyfradd trosi isel.Yn gyntaf, rhaid echdynnu DNA o nifer fawr o samplau fesul un, ac yna bydd y genynnau tramor yn cael eu canfod gan PCR.Fodd bynnag, mae'r canlyniadau yn aml yn fylchau ac yn fandiau gydag ychydig o eitemau o bryd i'w gilydd, ond mae'n amhosibl pennu a oes darganfyddiadau wedi'u methu neu ganfyddiadau ffug..Ydy hi'n ddiymadferth iawn wynebu proses a chanlyniadau arbrofol o'r fath?Peidiwch â phoeni, mae brawd yn eich dysgu sut i sgrinio planhigion positif trawsenynnol yn hawdd ac yn gywir.

Cam 1

Dyluniad paent preimio canfod

Darganfyddwch y genyn mewndarddol a'r genyn alldarddol i'w ganfod yn ôl y sampl i'w brofi, a dewiswch ddilyniant cynrychioliadol 100-500bp yn y genyn ar gyfer dylunio paent preimio.Gall preimwyr da sicrhau cywirdeb y canlyniadau canfod a byrhau'r amser canfod (gweler yr atodiad ar gyfer paent preimio canfod a ddefnyddir yn gyffredin).

Nodyn: Mae angen i'r paent preimio sydd newydd ei ddylunio wneud y gorau o'r amodau adwaith a gwirio cywirdeb, manwl gywirdeb a therfyn canfod y canfod cyn ei ganfod ar raddfa fawr.

Cam 2

Dylunio protocol arbrofol

Rheolaeth gadarnhaol: Defnyddiwch y DNA puredig sy'n cynnwys y darn targed fel templed i benderfynu a yw'r system adwaith PCR a'r amodau yn normal.

Rheolaeth negyddol/gwag: Defnyddiwch y templed DNA neu ddH2O nad yw'n cynnwys y darn targed fel templed i ganfod a oes ffynhonnell halogiad yn y system PCR.

Rheolaeth gyfeirio fewnol: defnyddiwch y cyfuniad paent preimio/chwiliwr o enyn mewndarddol y sampl i'w brofi i werthuso a all PCR ganfod y templed.

Sylwch:

Dylid gosod rheolaethau cadarnhaol, negyddol/gwag a rheolaethau rheolaeth fewnol ar gyfer pob prawf er mwyn gwerthuso dilysrwydd canlyniadau'r arbrawf.

Paratoi ar gyfer arbrawf

Cyn ei ddefnyddio, arsylwch a yw'r ateb wedi'i gymysgu'n gyfartal.Os canfyddir dyddodiad, mae angen ei doddi a'i gymysgu yn unol â'r cyfarwyddiadau cyn ei ddefnyddio.Mae angen pibedu cymysgedd 2 × PCR a'i gymysgu dro ar ôl tro gyda micropiped cyn ei ddefnyddio er mwyn osgoi dosbarthiad ïon anwastad.

Sylwch:

Tynnwch y llawlyfr allan a'i ddarllen yn ofalus, a gwnewch baratoadau cyn yr arbrawf yn unol â gofynion y llawlyfr.

Cam 4

Paratoi system adwaith PCR

Yn ôl y protocol arbrofol, cymysgwch y paent preimio, H2O, a 2 × PCR yn gyfartal, eu hallgyrchu a'u dosbarthu i bob tiwb adwaith.

Sylwch:

Ar gyfer profion ar raddfa fawr neu hirdymor, argymhellir defnyddio system adwaith PCR sy'n cynnwys ensym UNG, a all osgoi halogiad aerosol a achosir gan gynhyrchion PCR yn effeithiol.

Cam 5

Ychwanegu templed adwaith

Gan ddefnyddio technoleg Direct PCR, nid oes angen proses puro asid niwclëig diflas, gellir paratoi'r templed sampl o fewn 10 munud, a gellir ychwanegu'r system adwaith PCR cyfatebol.

Sylwch:

Mae gan y dull holltiad effaith ganfod well, a gellir defnyddio'r cynnyrch a gafwyd ar gyfer adweithiau canfod lluosog.

5.1: Ehangu dail yn uniongyrchol

Yn ôl maint y llun yn y llawlyfr, torrwch y meinwe dail gyda diamedr o 2-3mm a'i roi yn y system adwaith PCR.

Nodyn: Sicrhewch fod y darnau dail yn cael eu trochi'n llwyr yn yr ateb adwaith PCR, a pheidiwch ag ychwanegu meinwe dail gormodol.

5.2: Dull hollti dail

Torrwch feinwe'r ddeilen â diamedr o 5-7mm a'i roi mewn tiwb centrifuge.Os dewiswch ddail aeddfed, ceisiwch osgoi defnyddio meinweoedd prif wythïen y ddeilen.Pibed 50ul Clustog P1 lysate i mewn i tiwb centrifuge i sicrhau bod y lysate yn gallu trochi meinwe'r dail yn llwyr, ei roi mewn cylchredwr thermol neu baddon metel, a lyse ar 95 ° C am 5-10 munud.

Ychwanegu datrysiad niwtraliad Clustog 50ul P2 a chymysgu'n dda.Gellir defnyddio'r lysate canlyniadol fel templed a'i ychwanegu at y system adwaith PCR.

Sylwer: Mae swm y templed rhwng 5-10% o'r system PCR, ac ni ddylai fod yn fwy na 20% (er enghraifft, mewn system PCR 20μl, ychwanegwch 1-2μl o ddatrysiad lysis, dim mwy na 4μl).

Cam 6

Adwaith PCR

Ar ôl centrifugio'r tiwb adwaith PCR, caiff ei roi mewn offeryn PCR ar gyfer ymhelaethu.

Sylwch:

Mae'r adwaith yn defnyddio templed heb ei buro ar gyfer ymhelaethu, felly mae nifer y cylchoedd mwyhau 5-10 yn fwy o gylchoedd nag wrth ddefnyddio templed DNA wedi'i buro.

Cam 7

Canfod electrofforesis a dadansoddi canlyniadau

M: Ysgol DNA 100bp

1\4: Dull DNA wedi'i buro

2 \ 5: Dull PCR uniongyrchol

3\6: Rheolaeth wag

QC:

Dylai canlyniadau prawf y rheolaethau amrywiol a osodwyd yn yr arbrawf fodloni'r amodau canlynol.Fel arall, dylid dadansoddi achos y broblem, a dylid cynnal y prawf eto ar ôl i'r broblem gael ei dileu.

Tabl 1. Canlyniadau profion arferol gwahanol grwpiau rheoli

*Pan ddefnyddir y plasmid fel rheolydd positif, gall canlyniad y prawf genyn mewndarddol fod yn negyddol

Dyfarniad canlyniad:

A. Mae canlyniad prawf genyn mewndarddol y sampl yn negyddol, sy'n nodi na ellir tynnu'r DNA sy'n addas ar gyfer canfod PCR cyffredin o'r sampl neu mae'r DNA a echdynnwyd yn cynnwys atalyddion adwaith PCR, a dylid echdynnu'r DNA eto.

B. Mae canlyniad prawf genyn mewndarddol y sampl yn bositif, ac mae canlyniad prawf y genyn alldarddol yn negyddol, sy'n dangos bod DNA sy'n addas ar gyfer canfod PCR cyffredin yn cael ei dynnu o'r sampl, a gellir barnu nad yw'r genyn XXX yn cael ei ganfod yn y sampl.

C. Mae canlyniad prawf genyn mewndarddol y sampl yn bositif, ac mae canlyniad prawf y genyn alldarddol yn bositif, gan nodi bod DNA sy'n addas ar gyfer canfod PCR cyffredin wedi'i dynnu o'r sampl, ac mae'r sampl DNA yn cynnwys y genyn XXX.Gellir cynnal arbrofion cadarnhau ymhellach.

Cam 8

Dyluniad paent preimio canfod

Ar ôl yr arbrawf, defnyddiwch hydoddiant hypoclorit sodiwm 2% a hydoddiant ethanol 70% i sychu'r ardal arbrofol i atal llygredd amgylcheddol.