Ni all trawsgrifiadau gwrthdro traddodiadol oddef tymereddau uchel (y tymheredd gorau posibl ar gyfer gweithgaredd MMLV yw 37-50 ° C, ac AMV yw 42-60 ° C).Ni ellir gwrthdroi'r RNA firaol mwy cymhleth yn effeithiol yn cDNA ar dymheredd isel, gan arwain at effeithlonrwydd canfod Y gostyngiad.Yn gyffredinol, mae RT-qPCR traddodiadol yn gofyn am gyfranogiad dau ensym allweddol (trawsgrifiad gwrthdro a DNA polymeras), sy'n ei gwneud hi'n amhosibl symleiddio gweithrediad y system adwaith a lleihau'r gost.Yma byddwn yn cyflwyno dau drawsgrifiad gwrthdro sy'n gwrthsefyll tymheredd uchel, TtH a RevTaq.Mae gan y ddau ensym hyn hefyd swyddogaeth DNA polymeras, felly fe'u gelwir yn ensymau deuswyddogaethol.

TtH DNA polymeras

Mae'n rhaid eich bod wedi clywed am TtH, sy'n deillio o'r bacteriwm thermoffilig Thermus thermophilus HB8.Ym mhresenoldeb catïonau deufalent fel Mg2+, mae ganddo actifedd DNA polymeras.Fe'i defnyddir yn eang mewn adweithiau PCR fel ensym Taq, ond mae ganddo wrthwynebiad gwres uwch nag ensym Taq, felly mae hefyd yn cael effaith well ar PCR gyda thempledi cynnwys GC uchel.

· Yn y bôn nid oes gan yr ensym hwn unrhyw actifedd ecsonuclease 3′→5′ a gweithgaredd ecsonuclease 5′→3′, felly gellir ei ddefnyddio hefyd ar gyfer dilyniannu dideocsi.

· Mae gan yr ensym hwn actifedd RTase.Ym mhresenoldeb Mn2+, bydd gweithgaredd RTase yn cael ei wella.Gan ddefnyddio'r nodwedd hon, gellir ei ddefnyddio i berfformio adwaith trawsgrifio gwrthdro ac adwaith PCR yn yr un tiwb, hynny yw, un-cam RT-PCR.Fodd bynnag, ym mhresenoldeb Mn2+, nid yw cywirdeb RT-PCR yn uchel.Nid oes gan weithgaredd RT unrhyw beth i'w wneud â gweithgaredd rnaase H.

· Mae gweithgaredd cynyddol polymeras Tth-DNA (pH9, optimwm +55 ℃ ～ + 70 ℃, uchafswm +95 ℃) yn goresgyn y problemau a achosir gan strwythur eilaidd RNA.Gellir chwyddo'r cDNA sy'n deillio o hyn gan PCR gyda'r un ensym ym mhresenoldeb ïonau Mg2+.

· Mae gallu Tth-DNA polymeras i berfformio trawsgrifiad o chwith ac ymhelaethu DNA ar dymheredd uchel yn gwneud yr ensym hwn yn ddefnyddiol ar gyfer RT-PCR meintiol, clonio, a dadansoddiad mynegiant genynnau o RNA cellog a firaol.
· Defnyddir polymeras Tth-DNA ar gyfer RT-PCR i chwyddo RNA hyd at 1kb.

Nodweddion a manteision

Tth DNA polymeras:

• Sicrhewch fod maint y cynnyrch adwaith cadwyn polymeras wedi'i optimeiddio (PCR), o leiaf 1000 bp yn yr adwaith RT-PCR

• Derbyn deocsiriboniwcleosid triffosffad wedi'i addasu fel swbstrad

• Ddim yn gysylltiedig â gweithgaredd RNase H

• Yn meddu ar sefydlogrwydd thermol uchel i oresgyn problemau, fel arfer yn gysylltiedig â'r strwythur uwchradd uchel sy'n bresennol yn RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymeras

DNA polymeras sy'n gwrthsefyll gwres gyda gweithgaredd trawsgrifiad gwrthdro

Mae RevTaq-RT-PCR-DNA polymeras yn ensym deuol-weithredol wedi'i beiriannu, sy'n gwrthsefyll gwres iawn, gyda gweithgareddau trawsgrifio gwrthdro a DNA polymeras a geir trwy esblygiad artiffisial ac gyfeiriedig.

· Mae hanner oes polymeras DNA RevTaq RT-PCR ar 95°C yn fwy na 40 munud.

· Mae polymeras DNA RevTaq RT-PCR yn caniatáu trawsgrifio gwrthdro tymheredd uchel yn uniongyrchol o'r templed RNA, a gellir ailadrodd y cam trawsgrifio cefn sawl gwaith i gynhyrchu mwy o dempledi cDNA.

· Mae polymeras DNA RevTaq RT-PCR yn caniatáu RT-PCR “cam sero” (dim cam trawsgrifio gwrthdro isothermol), oherwydd yn y cam ymestyn cylchol PCR, mae trawsgrifio gwrthdro a mwyhad DNA yn digwydd ar yr un pryd.Mae hyn hefyd yn hyrwyddo'r adwaith trawsgrifio gwrthdro ar dymheredd uchel, a thrwy hynny leihau'r problemau a geir wrth doddi'r strwythur eilaidd cryf mewn RNA ar dymheredd uchel.

· Oherwydd y fformiwla cychwyn poeth sy'n seiliedig ar aptamer, bydd polymeras DNA RevTaq RT-PCR yn cynhyrchu canlyniadau gwell pan fydd y tymheredd anelio ac ymestyn yn uwch na 57°C.

· Gan fod yr ensym yn gallu gwrthsefyll gwres, argymhellir dylunio paent preimio a stilwyr gyda ymdoddbwyntiau uchel iawn (>60°C).

· Argymhellir optimeiddio tymheredd y cam anelio/estyn drwy raddiant tymheredd yn ystod y broses o sefydlu'r adwaith.

· Po uchaf yw'r tymheredd, yr uchaf yw penodoldeb PCR.Mae'r cylch trawsgrifio o'r cefn fel arfer yn cael ei berfformio ar dymheredd uwch na'r cylch PCR, oherwydd fel arfer mae gan DNA Primer: hybridization Templed bwynt toddi uwch na DNA Primer:cDNA Template deublyg.

· Mae polymeras DNA RevTaq RT-PCR wedi'i beiriannu'n enetig a'i optimeiddio, ac mae maint yr amplicon rhwng 60-300 bp.

Mae terfyn canfod DNA polymeras DNA RevTaq RT-PCR yn cyrraedd 4 copi /

Dangosir y system adwaith optimaidd (sefydlu paent preimio pwynt toddi uchel) yn y ffigur.RevTaq RT-PCR DNA polymerase-yrru RT-PCR yn dangos gwell sensitifrwydd na TaqPath 1-cam cymysgedd meistr RT-qPCR, a chanfod is Graddiant gwanhau Sampl.

Mwy o fanteision:

Swyddogaeth cychwyn cyflym → Gellir hepgor y cam dadnatureiddio thermol cychwynnol.

Fformiwla atamer cychwyn poeth → Darparwch actifedd ensymau 100% ar unwaith ac atal ymhelaethiad amhenodol ar dymheredd isel (<57°C).

Swyddogaeth holltiad → Mae'r cam echdynnu RNA wedi'i hepgor, oherwydd gall polymeras DNA RevTaq RT-PCR hefyd brosesu samplau adwaith crai.Gall ddinistrio cellbilenni ewcaryotau, bacteria a firysau ar unwaith mewn cylchred RT-PCR poeth.

Lefel deunydd crai IVD → safonau ansawdd uchel a phrisiau cystadleuol iawn