Deunydd cychwyn: RNA
Trawsgrifio gwrthdro meintiol Mae PCR (RT-qPCR) yn ddull arbrofol a ddefnyddir mewn arbrofion PCR gan ddefnyddio RNA fel y deunydd cychwyn.Yn y dull hwn, mae cyfanswm RNA neu RNA negesydd (mRNA) yn cael ei drawsgrifio i DNA cyflenwol (cDNA) yn gyntaf trwy drawsgrifiad gwrthdro.Yn dilyn hynny, perfformiwyd adwaith qPCR gan ddefnyddio'r cDNA fel templed.Mae RT-qPCR wedi'i ddefnyddio mewn amrywiaeth o gymwysiadau bioleg moleciwlaidd, gan gynnwys dadansoddi mynegiant genynnau, dilysu ymyrraeth RNA, dilysu micro-arae, canfod pathogenau, profion genetig, ac ymchwil i glefydau.
Dulliau un cam a dau gam ar gyfer RT-qPCR
Gellir cyflawni RT-qPCR trwy ddull un cam neu ddau gam.Mae RT-qPCR un cam yn cyfuno trawsgrifio gwrthdro ac ymhelaethiad PCR, gan ganiatáu transcriptase gwrthdro a DNA polymeras i gwblhau'r adwaith yn yr un tiwb o dan yr un amodau byffer.Mae RT-qPCR un cam yn gofyn am ddefnyddio paent preimio dilyniant-benodol yn unig.Mewn RT-qPCR dau gam, perfformir trawsgrifio gwrthdro a mwyhad PCR mewn dau diwb, gan ddefnyddio gwahanol glustogau wedi'u optimeiddio, amodau adwaith, a strategaethau dylunio paent preimio.
| Mantais | Anfantais | |
| Un Cam | Mae gan y dull hwn lai o wallau arbrofol gan fod y ddau adwaith yn cael eu gwneud mewn un tiwb
Mae llai o gamau pibio yn lleihau'r risg o halogiad
Yn addas ar gyfer ymhelaethu / sgrinio trwybwn uchel, yn gyflym ac yn atgynhyrchadwy | Ni ellir optimeiddio adweithiau dau gam ar wahân
Gan fod yr amodau adwaith yn cael eu peryglu trwy gyfuno'r adwaith dau gam, nid yw'r sensitifrwydd cystal â sensitifrwydd y dull dau gam
Mae nifer y targedau a ganfuwyd gan un sampl yn fach |
| Dau Gam | Y gallu i greu llyfrgelloedd cDNA sefydlog y gellir eu storio am gyfnodau hir o amser a'u defnyddio mewn adweithiau lluosog
Gellir chwyddo genynnau targed a genynnau cyfeirio o'r un llyfrgell cDNA heb fod angen llyfrgelloedd cDNA lluosog
Byfferau adwaith ac amodau adwaith sy'n galluogi optimeiddio rhediadau adwaith sengl
Detholiad hyblyg o amodau sbarduno | Mae defnyddio tiwbiau lluosog, a mwy o gamau pibio yn cynyddu'r risg o halogiad DNA, ac yn cymryd llawer o amser.
Mae angen mwy o optimeiddio na'r dull un cam |
Cynhyrchion cysylltiedig:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Un Cam) -SYBR Gwyrdd I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Un Cam)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix Ar gyfer Synthesis CDNA Llinyn Cyntaf
Pecyn Amser Real PCR Easyᵀᴹ-SYBR Gwyrdd I
Detholiad o gyfanswm RNA ac mRNA
Wrth ddylunio arbrawf RT-qPCR, mae'n bwysig penderfynu a ddylid defnyddio RNA cyfanswm neu mRNA wedi'i buro fel templed ar gyfer trawsgrifio o chwith.Er y gall mRNA ddarparu sensitifrwydd ychydig yn uwch, mae cyfanswm RNA yn dal i gael ei ddefnyddio'n aml.Y rheswm am hyn yw bod gan gyfanswm RNA fantais bwysicach fel deunydd cychwyn nag mRNA.Yn gyntaf, mae'r broses yn gofyn am lai o gamau puro, sy'n sicrhau adferiad meintiol gwell o dempled a normaleiddio canlyniadau'n well i rifau celloedd cychwyn.Yn ail, mae'n osgoi'r cam cyfoethogi mRNA, a all osgoi'r posibilrwydd o ganlyniadau sgiw oherwydd adferiadau gwahanol o wahanol mRNAs.Yn gyffredinol, gan fod meintioliad cymharol y genyn targed yn bwysicach na sensitifrwydd absoliwt y canfod yn y rhan fwyaf o gymwysiadau, mae cyfanswm RNA yn fwy addas yn y rhan fwyaf o achosion.
Preimio trawsgrifio gwrthdro
Yn y dull dau gam, gellir defnyddio tri dull gwahanol i gysefinio'r adwaith cDNA: paent preimio oligo(dT), paent preimio ar hap, neu preimwyr dilyniant-benodol.Yn nodweddiadol, defnyddir paent preimio oligo(dT) a preimwyr ar hap gyda'i gilydd.Mae'r paent preimio hyn yn anelio i'r llinyn mRNA templed ac yn darparu trawsgrifiad o chwith gyda man cychwyn ar gyfer synthesis.
| Detholiad primer | Strwythur a swyddogaeth | Mantais | Anfantais |
| Preimio Oligo(dT) (neu breimiwr oligo(dT) wedi'i angori) | Anelio estynedig i weddillion thymin yng nghynffon poly(A) mRNA;mae preimiwr angor oligo(dT) yn cynnwys G, C, neu A ar y pen 3′ (safle angor) | Synthesis o cDNA hyd llawn o mRNA poly(A) cynffon
Yn berthnasol pan fo llai o ddeunydd cychwyn ar gael
Mae safle angori yn sicrhau bod y paent preimio oligo(dT) yn clymu i gynffon poly(A) 5′ yr mRNA | Dim ond yn addas ar gyfer mwyhau genynnau gyda chynffonau poly(A).
Cael cDNA wedi'i gwtogi o'r safle preimio*2 mewn poly(A)
Tuedd i rwymo i'r diwedd 3′*
* Mae'r posibilrwydd hwn yn cael ei leihau os defnyddir paent preimio oligo(dT) angori |
| paent preimio ar hap
| 6 i 9 sylfaen o hyd, a all anelio i wefannau lluosog yn ystod trawsgrifio RNA | Anneal i bob RNA (tRNA, rRNA, ac mRNA)
Yn addas ar gyfer trawsgrifiadau gyda strwythur eilaidd sylweddol, neu pan fydd llai o ddeunydd cychwyn ar gael
Cynnyrch cDNA uchel | Mae cDNA yn cael ei drawsgrifio o'r chwith o bob RNA, nad yw'n ddymunol fel arfer a gall wanhau signal yr mRNA targed
cael cwtogi cDNA |
| preimio dilyniant-benodol | Preimio personol yn targedu dilyniannau mRNA penodol | llyfrgell cDNA benodol
Gwella sensitifrwydd
Defnyddio paent preimio qPCR o chwith | Dim ond yn gyfyngedig i synthesis genyn targed sengl |
Trawsgrifiad gwrthdroi
Mae transcriptase gwrthdro yn ensym sy'n defnyddio RNA i syntheseiddio DNA.Mae gan rai trawsgrifiadau gwrthdro weithgaredd RNase a gallant ddiraddio llinynnau RNA mewn llinynnau hybrid RNA-DNA ar ôl trawsgrifio.Os nad oes ganddo weithgaredd enzymatig RNase, gellir ychwanegu RNaseH ar gyfer effeithlonrwydd qPCR uwch.Mae ensymau a ddefnyddir yn gyffredin yn cynnwys trawsgrifiad gwrthdroi firws lewcemia Moloney murine a feirws myeloblastoma adar yn gwrthdroi transcriptase.Ar gyfer RT-qPCR, mae'n ddelfrydol dewis trawsgrifiad gwrthdro gyda thermostability uwch, fel y gellir perfformio synthesis cDNA ar dymheredd uwch, gan sicrhau trawsgrifiad llwyddiannus o RNAs gyda strwythur uwchradd uwch, tra'n cynnal eu gweithgaredd llawn trwy gydol yr adwaith, gan arwain at gynnyrch cDNA uwch.
Cynhyrchion cysylltiedig:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Gweithgaredd RNase H o drawsgrifiad cefn
Mae RNaseH yn gallu diraddio llinynnau RNA o ddwplecsau RNA-DNA, gan ganiatáu synthesis effeithlon o DNA llinyn dwbl.Fodd bynnag, wrth ddefnyddio mRNA hir fel templed, gall yr RNA gael ei ddiraddio'n gynamserol, gan arwain at cDNA cwtogi.Felly, mae'n aml yn fuddiol lleihau gweithgaredd RNaseH yn ystod clonio cDNA os dymunir synthesis trawsgrifiadau hir.Mewn cyferbyniad, mae trawsgrifiadau gwrthdro gyda gweithgaredd RNase H yn aml yn fuddiol ar gyfer cymwysiadau qPCR oherwydd eu bod yn gwella toddi dwplecsau RNA-DNA yn ystod y cylch cyntaf o PCR.
Dyluniad primer
Yn ddelfrydol, dylid dylunio paent preimio PCR a ddefnyddir ar gyfer y cam qPCR yn RT-qPCR i rychwantu cyffordd exon-exon, lle gallai paent preimio ymhelaethu rychwantu ffin exon-intron gwirioneddol.Gan nad yw dilyniannau DNA genomig sy'n cynnwys intron yn cael eu mwyhau, mae'r dyluniad hwn yn lleihau'r risg y bydd positifau ffug yn cael eu chwyddo o lygru DNA genomig.
Os na ellir dylunio paent preimio i wahanu ffiniau exons neu exon-exon, efallai y bydd angen trin samplau RNA â DNase I neu dsDNase heb RNase i gael gwared ar halogiad DNA genomig.
Rheolaeth RT-qPCR
Dylid cynnwys rheolaeth negyddol trawsgrifio gwrthdro (-RT control) ym mhob arbrawf RT-qPCR i ganfod halogiad DNA (fel DNA genomig neu gynhyrchion PCR o adweithiau blaenorol).Mae'r rheolydd hwn yn cynnwys yr holl gydrannau adwaith ac eithrio trawsgrifiad gwrthdro.Gan nad yw trawsgrifio o chwith yn digwydd gyda'r rheolaeth hon, os gwelir ymhelaethiad PCR, mae halogiad o DNA yn fwyaf tebygol.
Amser postio: Awst-02-2022
