Yng nghyfnod cynnar yr achosion, oherwydd y datblygiad cyflym, diagnosis cyflym o gleifion a amheuir yw'r allwedd i atal COVID-19.Mae gan rai adweithyddion canfod asid niwclëig cymeradwy amser datblygu byr, ac mae problemau megis cadarnhad perfformiad brysiog, optimeiddio adweithydd annigonol, a gwahaniaethau mawr rhwng sypiau;Gall problemau gwahanol labordai clinigol mewn gwahanol agweddau ar y broses canfod asid niwclëig hefyd effeithio ar gywirdeb canlyniadau canfod asid niwclëig.Bydd yr erthygl hon yn canolbwyntio ar y cysylltiadau a'r pwyntiau allweddol yn y darganfyddiad asid niwclëig presennol SARS-CoV-2, ac yn dadansoddi problemau ail-archwiliad negyddol a chadarnhaol ffug o ganfod asid niwclëig labordy ac anghysondeb clinigol.

Egwyddorion canfod asid niwclëig SARS-CoV-2

Mae SARS-CoV-2 yn firws RNA gyda dilyniant genom o tua 29 kb, gyda 10 genyn, a all amgodio 10 protein yn effeithiol.Mae firysau yn cynnwys RNA a phrotein, a'r haen allanol yw gorchudd allanol sy'n cynnwys lipidau a glycoproteinau.Y tu mewn, mae'r capsid protein yn lapio'r RNA ynddo, gan amddiffyn yr RNA hawdd ei ddiraddio (P1).

P1 Strwythur SARS-COV-2

Mae firysau'n ymosod ar gelloedd trwy dderbynyddion arwyneb celloedd penodol i achosi haint, ac yn defnyddio celloedd cynnal i ddyblygu.

Egwyddor canfod asid niwclëig firaol yw datgelu'r RNA firaol trwy lysate cell, ac yna defnyddio adwaith cadwynol trawsgrifio-polymerase gwrthdro fflwroleuol amser real (RT-PCR) i'w ganfod.

Yr allwedd i'r egwyddor canfod yw defnyddio paent preimio a stilwyr i gyflawni “paru wedi'i dargedu” o ddilyniannau asid niwclëig, hynny yw, dod o hyd i ddilyniant asid niwclëig SARS-CoV-2 sy'n wahanol i firysau eraill mewn tua 30,000 o seiliau (tebygrwydd asid niwclëig i firysau eraill) Ardal “Isel”), paent preimio a stilwyr.

Mae'r paent preimio a'r stilwyr yn cydweddu'n fawr â'r rhanbarth penodol o asid niwclëig SARS-CoV-2, hynny yw, mae'r penodoldeb yn gryf iawn.Unwaith y bydd canlyniad ymhelaethu fflwroleuol RT-PCR amser real y sampl sydd i'w brofi yn bositif, mae'n profi bod SARS-CoV-2 yn bresennol yn y sampl.Gweler T2.

P2 Camau pennu asid niwclëig SARS-CoV-2 (RT-PCR fflwroleuol amser real)

Amodau a gofynion labordy ar gyfer canfod asid niwclëig SARS-CoV-2

Labordai profi asid niwcleig yw'r rhai mwyaf delfrydol ar gyfer amgylcheddau pwysau negyddol, a dylent roi sylw i fonitro pwysau, cadw aer i lifo, a dileu aerosolau.Rhaid i bersonél profi asid niwcleig feddu ar gymwysterau cyfatebol, derbyn hyfforddiant adwaith cadwyn polymeras perthnasol a phasio'r asesiad.Dylai'r labordy gael ei reoli'n llym, ei barthu yn ei le, a gwaharddir personél amherthnasol rhag mynd i mewn.Dylai'r man glân gael ei awyru a'i ddiheintio yn ei le.Mae eitemau perthnasol yn cael eu gosod mewn parthau, yn lân ac yn fudr yn cael eu gwahanu, eu disodli mewn pryd, a'u dadheintio yn eu lle.Diheintio arferol: Diheintydd sy'n cynnwys clorin yw'r prif ateb ar gyfer ardaloedd mwy, a gellir defnyddio 75% o alcohol ar gyfer ardaloedd bach.Ffordd dda o ddelio ag aerosolau yw agor ffenestri ar gyfer awyru, a gellir diheintio aer hefyd trwy belydrau uwchfioled, hidlo a diheintio aer.

Cysylltiadau a pharamedrau allweddol penderfyniad asid niwclëig SARS-CoV-2 (RT-PCR fflwroleuol amser real)

Er bod labordai yn gyffredinol yn rhoi sylw manwl i “ganfod” asid niwclëig, mewn gwirionedd, mae “echdynnu” asid niwclëig hefyd yn un o'r camau allweddol ar gyfer canfod llwyddiannus, sydd â chysylltiad agos â chasglu a storio samplau firws.

Ar hyn o bryd, mae'r samplau anadlol a ddefnyddir yn fwyaf eang, megis swabiau nasopharyngeal, yn defnyddio'r ail ddull, sef datrysiad anactifadu (cadwraeth) a baratowyd yn seiliedig ar echdynnu asid niwclëig a hydoddiant lysis.Ar y naill law, gall yr ateb cadw firws hwn ddadnatureiddio protein y firws, colli ei weithgaredd a pheidio â bod yn heintus, a gwella diogelwch y cam cludo a chanfod;ar y llaw arall, gall gracio'r firws yn uniongyrchol i ryddhau'r asid niwclëig, dileu'r ensym dadelfennu asid niwclëig, ac atal y firws.Mae'r RNA wedi'i ddiraddio.

Hydoddiant samplu firws a baratowyd ar sail hydoddiant lysis echdynnu asid niwclëig.Y prif gydrannau yw halwynau cytbwys, asiant chelating asid ethylenediaminetetraacetic, halen guanidine (guanidine isothiocyanate, hydroclorid guanidine, ac ati), syrffactydd anionic (dodecane) Sodiwm sylffad), syrffactydd cationic (tetradecyl trimethyl amonium oxalate), ffenol, 8-proteinolethin, sawl cydran arall a phroteinolin, dihydroxythiner a mwy.Ar hyn o bryd, mae yna lawer o fathau o becynnau echdynnu asid niwclëig, a defnyddir gwahanol adweithyddion echdynnu a phuro asid niwclëig.Hyd yn oed os defnyddir yr un adweithydd echdynnu a phuro asid niwclëig, mae gweithdrefnau echdynnu pob pecyn yn wahanol.

Ar hyn o bryd, mae'r cynhyrchion pecyn canfod asid niwclëig a gymeradwywyd gan y Weinyddiaeth Cynhyrchion Meddygol Cenedlaethol yn cael eu dewis yn seiliedig ar y genynnau ORF1ab, E ac N yn y genom SARS-CoV-2.Mae egwyddorion canfod gwahanol gynhyrchion yr un peth yn y bôn, ond mae eu paent preimio a chynlluniau stiliwr yn wahanol.Mae yna segmentau targed sengl (ORF1ab), segmentau targed deuol (ORF1ab, N neu E), a segmentau tri tharged (ORF1ab, N ac E).Dylai'r gwahaniaeth rhwng canfod a dehongli, echdynnu asid niwclëig a system adwaith fflwroleuol RT-PCR amser real gyfeirio at y cyfarwyddiadau pecyn perthnasol, ac argymhellir bod defnyddwyr yn dilyn y dull dehongli a nodir yn y cyfarwyddiadau dehongli yn llym.Dangosir y rhanbarthau cyffredin, y paent preimio a'r dilyniannau stiliwr wedi'u chwyddo gan RT-PCR fflwroleuol amser real yn P3.

Ll3 Lleoliad targed amplicon SARS-CoV-2 ar y genom a dilyniant paent preimio a stilwyr

Dehongliad o ganlyniadau penderfyniad asid niwclëig SARS-CoV-2 (Real-Time fflwroleuol RT-PCR)

Am y tro cyntaf, eglurodd “Cynllun Atal a Rheoli Niwmonia ar gyfer Haint SARS-CoV-2 (Ail Argraffiad)” y meini prawf ar gyfer barnu canlyniadau ymhelaethu genyn sengl:

1. Dim Ct neu Ct≥40 yn negyddol;

2. Mae Ct<37 yn bositif;

3. Gwerth Ct o 37-40 yw'r ardal raddfa lwyd.Argymhellir ailadrodd yr arbrawf.Os bydd canlyniad ail-wneud Ct<40 a’r gromlin ymhelaethu ar eu huchafbwyntiau amlwg, bernir bod y sampl yn bositif, fel arall mae’n negyddol.”

Parhaodd trydydd argraffiad y canllaw a phedwerydd argraffiad y canllaw â'r meini prawf uchod.Fodd bynnag, oherwydd y gwahanol dargedau a ddefnyddir mewn citiau masnachol, ni roddodd y 3ydd argraffiad uchod o'r canllaw y meini prawf ar gyfer pennu'r cyfuniad o dargedau, gan bwysleisio Y cyfarwyddiadau a ddarperir gan y gwneuthurwr fydd drechaf.Gan ddechrau o bumed argraffiad y canllawiau, mae dau darged wedi'u hegluro, yn enwedig y meini prawf dyfarnu ar gyfer un targed sy'n anodd ei farnu.Hynny yw, os yw'r labordy am gadarnhau bod achos yn bositif ar gyfer canfod asid niwclëig SARS-CoV-2, mae angen bodloni'r canlynol mewn 1 o 2 amod:

(1) Mae dau darged o SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) yn yr un sampl yn cael eu profi'n bositif gan RT-PCR fflwroleuol amser real.Os yw targed unigol yn bositif, mae angen ailsamplu ac ailbrofi.Os yw canlyniadau'r prawf Os yw'r targed sengl yn dal yn bositif, fe'i bernir yn bositif.

(2) Dangosodd dau sampl o RT-PCR fflwroleuol amser real un targed positif ar yr un pryd neu roedd dau sampl o'r un math yn dangos canlyniad prawf positif targed sengl, y gellir ei farnu'n bositif.Fodd bynnag, mae'r canllawiau hefyd yn pwysleisio na all canlyniadau negyddol profion asid niwclëig eithrio haint SARS-CoV-2.Mae angen eithrio ffactorau a allai achosi negyddol ffug, gan gynnwys ansawdd sampl gwael (samplau anadlol o oropharyncs a rhannau eraill), casglu samplau yn rhy gynnar neu'n rhy hwyr, ni chafodd samplau eu storio, eu cludo a'u prosesu'n gywir, ac roedd gan y dechnoleg ei hun broblemau (amrywiad firws, ataliad PCR), ac ati.

Achosion negatifau ffug yn y canfyddiad SARS-CoV-2

Mae’r cysyniad o “negyddol ffug” mewn profion asid niwclëig sydd dan sylw ar hyn o bryd, yn aml yn cyfeirio at “negyddion ffug” lle mae canlyniadau profion asid niwclëig yn anghyson ag amlygiadau clinigol, hynny yw, mae symptomau clinigol a chanlyniadau delweddu yn cael eu hamau’n fawr o COVID-19, ond mae profion asid niwclëig bob amser yn “negyddol” lawer gwaith.Esboniodd Canolfan Labordy Clinigol y Comisiwn Iechyd Gwladol y prawf SARS-CoV-2 “negyddol ffug”.

(1) Mae rhywfaint o firws yng nghelloedd y person heintiedig.Mae data presennol yn dangos, ar ôl i'r corff gael ei heintio gan y firws, bod y firws yn mynd i mewn i'r gwddf trwy'r trwyn a'r geg, yna i'r tracea a'r bronci, ac yna'n cyrraedd yr alfeoli.Bydd y person heintiedig yn profi'r cyfnod magu, symptomau ysgafn, ac yna'r broses o symptomau difrifol, a gwahanol gamau o'r afiechyd.Ac mae faint o firws sy'n bresennol mewn gwahanol rannau o'r corff yn wahanol.

O ran y llwyth firaol o fathau o gelloedd, celloedd epithelial alfeolaidd (llwybr anadlol is)> celloedd epithelial llwybr anadlu (llwybr anadlol uchaf)> ffibroblastau, celloedd endothelaidd, a macrophages, ac ati;o'r math o sampl, hylif lavage alfeolaidd (y mwyaf Ardderchog)>spwtwm peswch dwfn>swab nasopharyngeal>swab oroffaryngeal>gwaed.Yn ogystal, gellir canfod y firws mewn feces hefyd.Fodd bynnag, o ystyried hwylustod llawdriniaeth a derbyniad cleifion, y gorchymyn sampl clinigol a ddefnyddir yn gyffredin yw swab oropharyngeal> swab nasopharyngeal> hylif lavage bronciol (gweithrediad cymhleth) a sbwtwm dwfn (peswch sych fel arfer, anodd ei gael).

Felly, mae maint y firws yng nghelloedd oropharyncs neu nasopharyncs rhai cleifion yn fach neu'n hynod o isel.Os mai dim ond samplau o'r oroffaryncs neu'r nasopharyncs a gymerir i'w profi, ni fydd yr asid niwclëig firaol yn cael ei ganfod.

(2) Ni chasglwyd unrhyw gelloedd sy'n cynnwys firws wrth gasglu samplau, ac ni chafodd asid niwclëig firaol ei gadw'n effeithiol.

[① Safle casglu amhriodol, er enghraifft, wrth gasglu swabiau oroffaryngeal, nid yw'r dyfnder casglu yn ddigon, ni chaiff y swabiau nasopharyngeal a gasglwyd eu casglu'n ddwfn yn y ceudod trwynol, ac ati. Gall y rhan fwyaf o'r celloedd a gesglir fod yn gelloedd di-feirws;

② Defnyddir swabiau samplu yn anghywir.Er enghraifft, argymhellir ffibrau synthetig megis ffibr PE, ffibr polyester a ffibr polypropylen ar gyfer deunydd y pen swab.Defnyddir ffibrau naturiol fel cotwm mewn gweithrediad gwirioneddol (arsugniad cryf o brotein ac nid yw'n hawdd ei olchi allan) A ffibrau neilon (amsugno dŵr gwael, gan arwain at gyfaint samplu annigonol);

③ Defnydd anghywir o diwbiau storio firws, megis camddefnyddio tiwbiau storio plastig polypropylen neu polyethylen sy'n hawdd i amsugno asidau niwclëig (DNA/RNA), gan arwain at ostyngiad yn y crynodiad o asid niwclëig yn yr hydoddiant storio.Yn ymarferol, argymhellir defnyddio plastig polymer polyethylen-propylen a rhai cynwysyddion plastig polypropylen wedi'u trin yn arbennig i storio asidau niwclëig firaol.]

[① Safle casglu amhriodol, er enghraifft, wrth gasglu swabiau oroffaryngeal, nid yw'r dyfnder casglu yn ddigon, ni chaiff y swabiau nasopharyngeal a gasglwyd eu casglu'n ddwfn yn y ceudod trwynol, ac ati. Gall y rhan fwyaf o'r celloedd a gesglir fod yn gelloedd di-feirws;

② Defnyddir swabiau samplu yn anghywir.Er enghraifft, argymhellir ffibrau synthetig megis ffibr PE, ffibr polyester a ffibr polypropylen ar gyfer deunydd y pen swab.Defnyddir ffibrau naturiol fel cotwm mewn gweithrediad gwirioneddol (arsugniad cryf o brotein ac nid yw'n hawdd ei olchi allan) A ffibrau neilon (amsugno dŵr gwael, gan arwain at gyfaint samplu annigonol);

③ Defnydd anghywir o diwbiau storio firws, megis camddefnyddio tiwbiau storio plastig polypropylen neu polyethylen sy'n hawdd i amsugno asidau niwclëig (DNA/RNA), gan arwain at ostyngiad yn y crynodiad o asid niwclëig yn yr hydoddiant storio.Yn ymarferol, argymhellir defnyddio plastig polymer polyethylen-propylen a rhai cynwysyddion plastig polypropylen wedi'u trin yn arbennig i storio asidau niwclëig firaol.]

(4) Nid yw gweithrediad y labordy clinigol wedi'i safoni.Amodau cludo a storio sampl, gweithrediad safonol labordai clinigol, dehongli canlyniadau a rheoli ansawdd yw'r ffactorau allweddol i sicrhau cywirdeb a dibynadwyedd canlyniadau profion.Yn ôl canlyniadau'r gwerthusiad ansawdd allanol a gynhaliwyd gan Ganolfan Labordy Clinigol y Comisiwn Iechyd Gwladol ar Fawrth 16-24, 2020, o'r 844 o labordai a gafodd ganlyniadau dilys, roedd 701 (83.1%) yn gymwys, ac nid oedd 143 (16.9%) yn gymwys.Yn gymwys, mae'r amodau profi labordy cyffredinol yn dda, ond mae gan wahanol labordai wahaniaethau o hyd mewn gallu gweithredu personél, gallu dehongli sampl cadarnhaol un targed, a rheoli ansawdd.

Sut i leihau'r negyddol ffug o ganfod asid niwclëig SARS-CoV-2?

Dylid optimeiddio lleihau negyddion ffug mewn canfod asid niwclëig o'r pedair agwedd ar gynhyrchu negatifau ffug.

(1) Mae rhywfaint o firws yng nghelloedd y person heintiedig.Bydd crynodiad y firws mewn gwahanol rannau o gorff pobl yr amheuir eu bod wedi'u heintio yn wahanol ar wahanol adegau.Os nad oes pharyncs, gall fod mewn hylif lavage bronciol neu feces.Os gellir casglu mathau lluosog o samplau ar yr un pryd neu ar wahanol gamau o ddatblygiad afiechyd i'w profi, Bydd yn helpu i osgoi negyddol ffug.

(2) Dylid casglu celloedd sy'n cynnwys firws yn ystod casglu sampl.Gellir datrys y broblem hon i raddau helaeth trwy gryfhau hyfforddiant casglwyr sampl.

(3) adweithyddion IVD dibynadwy.Trwy gynnal ymchwil ar werthusiad perfformiad canfod adweithyddion ar lefel genedlaethol, a thrafod y problemau presennol, gellir gwella effeithlonrwydd canfod adweithyddion ymhellach a gellir gwella sensitifrwydd dadansoddi.

(4) Gweithrediad safonol labordai clinigol.Trwy gryfhau hyfforddiant personél labordy, gwella'r system rheoli ansawdd labordy yn barhaus, gan sicrhau rhaniadau rhesymol, a gwella gallu personél i ganfod, mae'n bosibl lleihau negatifau ffug oherwydd gweithrediadau labordy amhriodol.

Rhesymau dros ail-brawf positif prawf asid niwclëig SARS-CoV-2 mewn cleifion sy'n cael eu hadfer a'u rhyddhau

Mae'r “Cynllun Diagnosis a Thriniaeth COVID-19 (Seithfed Argraffiad Treial)” yn nodi'n glir mai un o'r meini prawf ar gyfer gwella a rhyddhau cleifion COVID-19 o'r ysbyty yw bod gan ddau sampl llwybr anadlol olynol brawf asid niwclëig negyddol (o leiaf 24 awr ar wahân), ond ychydig iawn oedd y prawf asid niwclëig SARS-CoV-2 eto oherwydd rhesymau cadarnhaol amrywiol a ryddhawyd i gleifion asid niwclëig.

(1) Mae SARS-CoV-2 yn firws newydd.Mae angen deall ymhellach ei fecanwaith pathogenig, darlun llawn y clefyd a achosir a nodweddion cwrs y clefyd.Felly, ar y naill law, mae angen cryfhau rheolaeth cleifion sy'n cael eu rhyddhau a chynnal arsylwi meddygol 14 diwrnod.Cynnal gwaith dilynol, monitro iechyd a chanllawiau iechyd i ddyfnhau'r ddealltwriaeth o'r broses gyfan o ddigwyddiad, datblygiad a chanlyniad y clefyd.

(2) Gall y claf gael ei heintio â'r firws eto.Dywedodd yr academydd Zhong Nanshan: Oherwydd bod gan gleifion wedi'u halltu wrthgyrff, gall gwrthgyrff ddileu SARS-CoV-2 pan fyddant yn goresgyn eto.Mae yna lawer o resymau, a all fod yn achos y claf sydd wedi gwella, neu gall fod yn gysylltiedig â threiglad y firws, neu hyd yn oed achos profion labordy.Os mai'r firws ei hun ydyw, gall y treiglad SARS-CoV-2 achosi i'r gwrthgorff a gynhyrchir gan y claf a adferwyd fod yn aneffeithiol yn erbyn y firws treigledig.Os yw'r claf wedi'i heintio â'r firws treigledig eto, gall y prawf asid niwclëig fod yn bositif eto.

(3) O ran dulliau profi labordy, mae gan bob dull profi ei gyfyngiadau.Mae canfod asid niwclëig SARS-CoV-2 oherwydd y dewis o ddilyniant genynnau, cyfansoddiad adweithyddion, sensitifrwydd y dull a rhesymau eraill, gan arwain at fod gan y citiau presennol eu terfynau canfod is eu hunain.Ar ôl i'r claf gael ei drin, mae'r firws yn y corff yn lleihau.Pan fydd y llwyth firaol yn y sampl sydd i'w brofi yn is na'r terfyn canfod isaf, bydd canlyniad "negyddol" yn ymddangos.Fodd bynnag, nid yw'r canlyniad hwn yn golygu bod y firws yn y corff wedi diflannu'n llwyr.Gall y firws fod ar ôl i'r driniaeth ddod i ben.Resurgence”, parhau i gopïo.Felly, argymhellir adolygu unwaith yr wythnos o fewn 2 i 4 wythnos ar ôl rhyddhau.

(4) Asid niwcleig yw deunydd genetig y firws.Mae'r firws yn cael ei ladd ar ôl i'r claf gael triniaeth gwrthfeirysol, ond mae'r darnau RNA firaol sy'n weddill yn dal i gael eu cadw yn y corff dynol, ac nid ydynt yn cael eu rhyddhau'n llwyr o'r corff.Weithiau, o dan rai amgylchiadau, gellir ei gadw'n fwy.Amser hir, ac ar yr adeg hon bydd y prawf asid niwclëig yn bositif “dros dro”.Gydag estyniad amser adfer y claf, ar ôl i'r darnau RNA gweddilliol yn y corff gael eu disbyddu'n raddol, gall canlyniad y prawf asid niwclëig droi'n negyddol.

(5) Nid yw canlyniad prawf asid niwclëig SARS-CoV-2 ond yn profi presenoldeb neu absenoldeb RNA firaol, ac ni all brofi gweithgaredd y firws ac a yw'r firws yn drosglwyddadwy.Mae angen profi a fydd claf sy'n cael prawf asid niwclëig positif eto yn dod yn ffynhonnell haint eto.Mae angen cynnal diwylliant firws ar samplau clinigol a meithrin firws “byw” i brofi ei fod yn heintus.

Crynodeb

I grynhoi, ni ellir yn llwyr osgoi profion asid niwclëig SARS-CoV-2 negyddol ffug, ailbrofi positifau, ac amodau eraill sy'n anghyson ag amlygiadau clinigol.Mewn sgrinio a phrofi gwirioneddol, argymhellir cyfuno symptomau clinigol, arholiadau delweddu (CT) ac arbrofion Canlyniadau prawf labordy (prawf asid niwclëig + prawf gwrthgyrff firws-benodol) ar gyfer diagnosis cynhwysfawr i atal diagnosis a chamddiagnosis.Os canfyddir bod canlyniadau'r profion yn amlwg yn anghyson â'r amlygiadau clinigol, argymhellir cynnal dadansoddiad cynhwysfawr o'r cyswllt prawf cyfan (casglu samplau, cylchrediad a phrosesu cysylltiadau) i eithrio haint firws SARS-CoV-2 cynnar, haint rheolaidd neu wedi'i gyfuno â heintiau firws anadlol eraill, ac ati posibl.Os yw amodau'n caniatáu, argymhellir casglu samplau mwy sensitif fel sbwtwm neu hylif lavage alfeolaidd i'w hailarchwilio.

Cynhyrchion Cysylltiedig:

Pecyn Canfod Asid Niwcleig SARS-CoV-2 (Dull Ymchwilio Fflwroleuol Amlblecs PCR)