Mae pawb yn sôn am yr egwyddor o arbrawf qRT-PCR, dyluniad paent preimio, dehongli canlyniadau, ac ati, ond credaf y dylwn rannu gyda chi weithrediad arbrofol qRT-PCR.Mae'n fach, ond mae'n ymwneud â chanlyniadau.

Cyn gwneud qRT-PCR, mae angen i ni gael dealltwriaeth glir o'n dulliau RNA a gweithredu ein hunain.Wedi'r cyfan, mae ein hymdrechion wedi'u hanelu at gael canlyniadau, yn hytrach nag ymarfer yn unig.Felly cyn gwneud qRT-PCR, mae angen i ni benderfynu ar y materion canlynol (mae rhai ohonynt yn berthnasol i SYBR yn unig).

1 Ydych chi'n siŵr nad yw eich RNA wedi'i ddiraddio?

Dim ond crynodiad a phurdeb RNA y gall NanoDrop 2000 eu canfod, ond ni allant ganfod uniondeb RNA.

Gall y gwerth RNA (Rhif Intesity RNA) adlewyrchu cyfanrwydd yr RNA, sy'n cael ei ganfod gan system Biodadansoddwr Agilent 2100.

Ffig. Diagram sgematig o werthoedd RIN ar gyfer gwahanol samplau RNA (ewcaryotau)

Fodd bynnag, yn gyffredinol nid oes gan labordai Agilent 2100 Bioanalyzer.Yn yr achos hwn, gallwn ganfod trwy gel fformaldehyd, ond mae'r gofyniad am gyfanswm yr RNA yn uchel, felly y dull cyflymaf yw defnyddio electrofforesis gel arferol.Mae'n ofynnol iddo fod mewn amgylchedd di-niwclease, felly mae angen rinsio'r tanc electrofforesis, potel sol, braced gel a chrib â dŵr DEPC.Mae'r agarose hefyd yn rhydd o nuclease (cyn belled â'i fod yn cael ei agor yn ffres), a dylid agor y Clustog Llwytho yn ffres gymaint â phosibl, gyda gel 1.2%.

Sylwch fod yn rhaid i'r gel gael ei diddymu'n llwyr, fel arall bydd yn achosi bandiau anhomogenaidd, fel y dangosir yn sampl 9 yn y ffigur.Os yw'r foltedd yn rhy uchel neu'n rhedeg am gyfnod rhy hir, bydd yn cynhyrchu gwres ac yn achosi diraddio RNA, felly dylid rheoli'r foltedd a'r amser yn rhesymol.Yn ogystal, gall rhedeg gel hefyd benderfynu ymhellach a oes gweddillion DNA yn y sampl, ac arsylwi a oes nifer fawr o fandiau cadw yn y ffynnon ddosbarthu.

Ffigur.Electrofforesis gel canfod RNA

2 Ydych chi'n siŵr am grynodiad eich cDNA?

Profiad y brodyr mawr yn y labordy yw bod cDNA y system 20 ul a geir gan bob gwrthdroad yn cael ei wanhau'n uniongyrchol 20X, tra bod y chwiorydd ôl-ddoethurol yn cael eu gwanhau 10X.Dwi fel arfer yn dibynnu ar y sefyllfa.Oherwydd bod ansawdd yr RNA a grybwyllir gan bob person yn wahanol, mae lefel y gwrthdroad hefyd yn wahanol, ac efallai na fydd y dechnoleg gwrthdroi yn sefydlog.

Felly bob tro y byddaf yn cael y cDNA wedi'i wrthdroi, byddaf yn ei wanhau tua 3 gwaith yn gyntaf, ac yna'n defnyddio'r genyn cadw tŷ i wneud RT-PCR, mae nifer y cylchoedd yn gyffredinol yn 25 cylch, i nodi'r crynodiad penodol, ac yna penderfynu ar y ffactor gwanhau terfynol.

3 Ydych chi'n siŵr bod eich paent preimio yn hawdd i'w ddefnyddio?

Gall basio cromlin toddi qRT-PCR, ond mae hyn yn dal i gostio arian.Ar gyfer labordai heb lawer o arian, pan fyddant yn cael llawer o preimio, gallant ddefnyddio RT-PCR cyffredin i weld a yw'n fand sengl a nodi penodoldeb y paent preimio.Os nad yw'r labordy yn brin o arian, gellir nodi penodoldeb yr holl preimwyr unwaith trwy'r gromlin doddi.

4 A ydych yn siŵr bod eich amodau arbrofol yn addas?

Dylid amddiffyn SYBR rhag golau cryf, felly ceisiwch ddiffodd y golau uwchben wrth ychwanegu adweithydd SYBR, a dim ond golau gwan sydd angen ei ddefnyddio i'w gwblhau.

Storio SYBR ar 4°C.Pan fyddwch chi'n cael ei ddefnyddio, dylech wrthdroi'n raddol i fyny ac i lawr i gymysgu'n dda er mwyn osgoi ewynnu, a pheidiwch ag vortex yn egnïol.

Mae rhai chwiorydd iau yn hoffi tynnu marciau ar y bwrdd PCR rhag ofn cymysgu'r samplau, sy'n anghywir.Gan fod eich marcwyr yn debygol iawn o effeithio ar gasglu signalau fflwroleuol, rwy'n argymell yn gyffredinol i blant iau ddefnyddio llyfrau nodiadau arbrofol i gynorthwyo gyda'r cof, fel y dangosir isod.

Ffigur.diagram llwytho sampl qRT-PCR

5 Ydych chi'n siŵr eich bod chi'n gwneud pethau'n iawn?

Cofiwch wisgo menig, gwisgo menig, gwisgo menig, a dweud pethau pwysig dair gwaith.

Er mwyn lleihau amlygiad SYBR i olau, hoffwn yn bersonol ychwanegu templed yn gyntaf, fel y dangosir yn y ffigur isod.Yn ôl profiad, mae ychwanegu ychydig bach o dempled yn debygol o achosi gwallau samplu.Felly, er mwyn lleihau'r gwall a achosir gan ychwanegu swm bach o dempled, rwyf fel arfer yn dyblu'r sampl eto, ac yn dyblu'r swm wrth ychwanegu'r sampl i leihau faint o H2O2 a ychwanegir.

Ffigur.Diagram sgematig o lwytho qRT-PCR

Yna ffurfweddwch y system qRT-PCR fel a ganlyn.

Ffigur.diagram paratoi system qRT-PCR

SYLWCH: Mae angen gwneud y broses ffurfweddu ar rew.

Ar ôl ychwanegu'r sampl, gludwch y ffilm selio dryloyw.Ceisiwch beidio â chyffwrdd ag wyneb y ffilm selio dryloyw â'ch dwylo, dim ond gweithredu o'r gofod ar ddwy ochr y ffilm.Oherwydd y gall olion bysedd hefyd effeithio ar gasglu signalau fflwroleuol.Yna defnyddio centrifuge i centrifuge gyflym am 10 s ar gyflymder isel i atal y sampl rhag hongian ar y wal.

Cynhyrchion Cysylltiedig:

Pecyn Cell Uniongyrchol RT-qPCR

RT Hawdd II