• Mae PCR yn ddull a ddefnyddir i chwyddo DNA o ychydig bach o dempled DNA.Mae RT-PCR yn defnyddio trawsgrifiad o chwith i gynhyrchu templed DNA o ffynhonnell RNA y gellir ei chwyddo wedyn.
• Mae PCR ac RT-PCR fel arfer yn adweithiau terfynbwynt, tra bod qPCR a RT-qPCR yn defnyddio cineteg cyfradd synthesis cynnyrch yn ystod yr adwaith PCR i feintioli faint o dempled sy'n bresennol.
• Mae dulliau mwy newydd, fel PCR digidol, yn darparu meintioliad absoliwt o'r templed DNA cychwynnol, tra bod dulliau fel PCR isothermol yn lleihau'r angen am offer drud i ddarparu canlyniadau dibynadwy.

Mae adwaith cadwynol polymeras (PCR) yn dechneg bioleg foleciwlaidd gymharol syml a ddefnyddir yn eang i ymhelaethu a chanfod dilyniannau DNA ac RNA.O'i gymharu â dulliau traddodiadol o glonio DNA ac ymhelaethu, a all gymryd dyddiau'n aml, dim ond ychydig oriau sydd eu hangen ar PCR.Mae PCR yn hynod sensitif ac mae angen ychydig o dempled ar gyfer canfod ac ymhelaethu ar ddilyniannau penodol.Mae dulliau PCR sylfaenol wedi datblygu ymhellach o ganfod DNA ac RNA syml.Isod, rydym wedi darparu trosolwg o'r gwahanol ddulliau PCR a'r adweithyddion a ddarparwn yn Enzo Life Sciences ar gyfer eich anghenion ymchwil.Ein nod yw helpu gwyddonwyr i gael mynediad cyflym i adweithyddion PCR i'w defnyddio yn eu prosiect ymchwil nesaf!

PCR

Ar gyfer PCR safonol, y cyfan sydd ei angen arnoch yw DNA polymeras, magnesiwm, niwcleotidau, paent preimio, y templed DNA i'w chwyddo, a thermocwlydd.Mae'r mecanwaith PCR mor syml â'i ddiben: 1) mae DNA llinyn dwbl (dsDNA) wedi'i ddadnatureiddio â gwres, 2) preimwyr yn alinio i'r llinynnau DNA sengl, a 3) mae'r paent preimio yn cael ei ymestyn gan DNA polymeras, gan arwain at ddau gopi o'r llinyn DNA gwreiddiol.Gelwir y broses dadnatureiddio, anelio ac elongation dros gyfres o dymereddau ac amseroedd yn un cylch o ymhelaethu (Ffig. 1).

Dylid optimeiddio pob cam o'r gylchred ar gyfer y templed a'r set preimio a ddefnyddir.Mae'r cylch hwn yn cael ei ailadrodd tua 20-40 gwaith, ac yna gellir dadansoddi'r cynnyrch chwyddedig, fel arfer gan gel agarose (Ffig. 2).

Gan fod PCR yn ddull hynod sensitif a bod angen cyfeintiau bach iawn ar gyfer adweithiau sengl, argymhellir paratoi prif gymysgedd ar gyfer sawl adwaith.Rhaid i'r prif gymysgedd gael ei gymysgu'n dda ac yna ei rannu â nifer yr adweithiau, gan sicrhau y bydd pob adwaith yn cynnwys yr un faint o ensym, dNTPs, a preimwyr.Mae llawer o gyflenwyr, fel Enzo Life Sciences, hefyd yn cynnig cymysgeddau PCR sydd eisoes yn cynnwys popeth heblaw paent preimio a'r templed DNA.

Mae rhanbarthau sy'n gyfoethog mewn Guanin/Cytosin (Cyfoethog GC) yn her mewn technegau PCR safonol.Mae dilyniannau llawn GC yn fwy sefydlog na dilyniannau gyda chynnwys GC is.At hynny, mae dilyniannau cyfoethog GC yn tueddu i ffurfio strwythurau eilaidd, fel dolenni pin gwallt.O ganlyniad, mae'n anodd gwahanu llinynnau dwbl cyfoethog GC yn llwyr yn ystod y cyfnod dadnatureiddio.O ganlyniad, ni all DNA polymeras syntheseiddio'r llinyn newydd heb rwystr.Gall tymheredd dadnatureiddio uwch wella hyn, a gall addasiadau tuag at dymheredd anelio uwch ac amser anelio byrrach atal rhwymiad amhenodol paent preimio llawn GC.Gall adweithyddion ychwanegol wella ymhelaethiad ar ddilyniannau cyfoethog GC.Mae DMSO, glyserol, a betaine yn helpu i amharu ar y strwythurau eilaidd a achosir gan ryngweithiadau GC a thrwy hynny hwyluso gwahanu'r llinynnau dwbl.

Cychwyn Poeth PCR

Mae ymhelaethu amhenodol yn broblem a all ddigwydd yn ystod PCR.Mae'r rhan fwyaf o bolymerasau DNA a ddefnyddir ar gyfer PCR yn gweithio orau ar dymheredd o tua 68°C i 72°C.Fodd bynnag, gall yr ensym hefyd fod yn actif ar dymheredd is, er i raddau is.Ar dymheredd sy'n llawer is na'r tymheredd anelio, gall preimwyr rwymo'n amhenodol ac arwain at fwyhau amhenodol, hyd yn oed os yw'r adwaith wedi'i sefydlu ar rew.Gellir atal hyn trwy ddefnyddio atalyddion polymeras sy'n daduno o'r DNA polymeras dim ond ar ôl cyrraedd tymheredd penodol, a dyna pam y term cychwyn poeth PCR.Gall yr atalydd fod yn wrthgorff sy'n clymu'r polymeras ac yn dadnatureiddio ar y tymheredd dadnatureiddio cychwynnol (95 ° C fel arfer).

Polymerase Ffyddlondeb Uchel

Tra bod DNA polymerasau yn ymhelaethu'n weddol gywir i'r dilyniant templed gwreiddiol, gall camgymeriadau wrth baru niwcleotid ddigwydd.Gall camgyfatebiaethau mewn cymwysiadau fel clonio arwain at drawsgrifiadau cwtogi, a phroteinau wedi'u cam-gyfieithu neu broteinau anactif i lawr yr afon.Er mwyn osgoi'r anghysondebau hyn, mae polymerasau â gweithgaredd “prawfddarllen” wedi'u nodi a'u hymgorffori yn y llif gwaith.Nodwyd y polymeras prawfddarllen cyntaf, Pfu, ym 1991 yn Pyrococcus furiosus.Mae gan yr ensym Pfu hwn actifedd exonuclease 3' i 5'.Wrth i'r DNA gael ei fwyhau, mae'r ecsonuclease yn cael gwared ar niwcleotidau anghydweddol ym mhen 3' y llinyn.Yna caiff y niwcleotid cywir ei ddisodli, ac mae synthesis DNA yn parhau.Mae adnabod dilyniannau niwcleotid anghywir yn seiliedig ar yr affinedd rhwymo ar gyfer y niwcleosid triphosphate cywir â'r ensym, lle mae rhwymo aneffeithlon yn arafu'r synthesis ac yn caniatáu amnewidiad cywir.Mae gweithgaredd prawfddarllen Pfu polymerase yn arwain at lai o wallau yn y dilyniant terfynol o'i gymharu â Taq DNA polymeras.Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae ensymau prawfddarllen eraill wedi'u nodi, a gwnaed addasiadau i'r ensym Pfu gwreiddiol i leihau'r gyfradd gwallau ymhellach yn ystod ymhelaethu DNA.

RT-PCR

Trawsgrifio gwrthdro Mae PCR, neu RT-PCR, yn caniatáu defnyddio RNA fel templed.Mae cam ychwanegol yn caniatáu canfod ac ymhelaethu ar RNA.Mae'r RNA yn cael ei drawsgrifio i'r gwrthwyneb yn DNA cyflenwol (cDNA), gan ddefnyddio trawsgrifiad cefn.Mae ansawdd a phurdeb y templed RNA yn hanfodol ar gyfer llwyddiant RT-PCR.Cam cyntaf RT-PCR yw synthesis hybrid DNA/RNA.Mae gan transcriptase gwrthdro hefyd swyddogaeth RNase H, sy'n diraddio cyfran RNA y hybrid.Yna mae'r moleciwl DNA un edefyn yn cael ei gwblhau gan weithgaredd polymeras DNA-ddibynnol y trawsgrifiad cefn i cDNA.Gall effeithlonrwydd yr adwaith llinyn cyntaf effeithio ar y broses ymhelaethu.O hyn ymlaen, defnyddir y weithdrefn PCR safonol i chwyddo'r cDNA.Mae llawer o fanteision i'r posibilrwydd o ddychwelyd RNA yn cDNA gan RT-PCR, ac fe'i defnyddir yn bennaf ar gyfer dadansoddi mynegiant genynnau.Mae RNA yn un llinyn ac yn ansefydlog iawn, sy'n ei gwneud hi'n heriol gweithio ag ef.Yn aml mae'n gam cyntaf yn qPCR, sy'n meintioli trawsgrifiadau RNA mewn sampl biolegol.

qPCR ac RT-qPCR

Defnyddir PCR meintiol (qPCR) i ganfod, nodweddu a meintioli asidau niwclëig ar gyfer nifer o gymwysiadau.Yn RT-qPCR, mae trawsgrifiadau RNA yn aml yn cael eu meintioli trwy eu trawsgrifio'n ôl yn cDNA yn gyntaf, fel y disgrifir uchod, ac yna cynhelir qPCR wedyn.Fel yn PCR safonol, mae DNA yn cael ei chwyddo gan dri cham ailadrodd: dadnatureiddio, anelio, ac ehangiad.Fodd bynnag, yn qPCR, mae labelu fflwroleuol yn galluogi casglu data wrth i PCR fynd rhagddo.Mae gan y dechneg hon lawer o fanteision oherwydd yr ystod o ddulliau a chemegau sydd ar gael.

Mewn qPCR seiliedig ar liw (gwyrdd fel arfer), mae labelu fflwroleuol yn caniatáu meintioli'r moleciwlau DNA chwyddedig trwy ddefnyddio llifyn rhwymo dsDNA.Yn ystod pob cylchred, mae'r fflworoleuedd yn cael ei fesur.Mae'r signal fflworoleuedd yn cynyddu'n gymesur â faint o DNA a atgynhyrchir.Felly, mae'r DNA yn cael ei feintioli mewn “amser real” (Ffig. 3).Yr anfanteision i qPCR sy'n seiliedig ar liw yw mai dim ond un targed y gellir ei archwilio ar y tro ac y bydd y llifyn yn clymu i unrhyw ds-DNA sy'n bresennol yn y sampl.

Mewn qPCR sy'n seiliedig ar stiliwr, gellir canfod llawer o dargedau ar yr un pryd ym mhob sampl, ond mae hyn yn gofyn am optimeiddio a dylunio chwiliwr(au) targed-benodol a ddefnyddir yn ogystal â phremwyr.Mae sawl math o ddyluniadau chwiliwr ar gael, ond y math mwyaf cyffredin yw chwiliedydd hydrolysis, sy'n cynnwys fflworoffor a diffoddwr.Mae trosglwyddo egni cyseiniant fflworoleuedd (FRET) yn atal allyriad y fflworoffor trwy'r diffoddwr tra bod y stiliwr yn gyfan.Fodd bynnag, yn ystod yr adwaith PCR, mae'r stiliwr yn cael ei hydrolysu yn ystod estyniad paent preimio ac ymhelaethu ar y dilyniant penodol y mae'n rhwym iddo.Mae holltiad y stiliwr yn gwahanu'r fflworoffor oddi wrth y quencher ac yn arwain at gynnydd yn y fflworoleuedd sy'n dibynnu ar ymhelaethu (Ffig. 4).Felly, mae'r signal fflworoleuedd o adwaith qPCR sy'n seiliedig ar stiliwr yn gymesur â swm y dilyniant targed stiliwr sy'n bresennol yn y sampl.Oherwydd bod qPCR sy'n seiliedig ar stiliwr yn fwy penodol na qPCR sy'n seiliedig ar liw, dyma'r dechnoleg a ddefnyddir yn aml mewn profion diagnostig sy'n seiliedig ar qPCR.

Helaethiad Isothermol

Mae'r technegau PCR a grybwyllir uchod yn gofyn am offer thermocycling drud i gynyddu ac i lawr tymheredd y siambr yn gywir ar gyfer y camau dadnatureiddio, anelio ac ymestyn.Mae nifer o dechnegau wedi'u datblygu nad oes angen dyfeisiau mor fanwl arnynt a gellir eu perfformio mewn baddon dŵr syml neu hyd yn oed o fewn y celloedd o ddiddordeb.Gyda'i gilydd, gelwir y technegau hyn yn ymhelaethu isothermol a gwaith yn seiliedig ar ymhelaethu esbonyddol, llinol neu raeadrol.

Y math mwyaf adnabyddus o ymhelaethu isothermol yw ymhelaethu isothermol dolen-gyfryngol, neu LAMP.Mae LAMP yn defnyddio mwyhad esbonyddol ar 65⁰C i fwyhau templed DNA neu RNA.Wrth berfformio LAMP, defnyddir pedwar i chwe preimiwr sy'n ategu rhannau o'r DNA targed gyda DNA polymeras i syntheseiddio DNA newydd.Mae gan ddau o'r paent preimio hyn ddilyniannau cyflenwol sy'n adnabod dilyniannau yn y paent preimio eraill ac yn eu clymu, gan ganiatáu ar gyfer strwythur “dolen” i ffurfio yn y DNA sydd newydd ei syntheseiddio sydd wedyn yn cynorthwyo anelio paent preimio mewn rowndiau mwyhau dilynol.Gellir delweddu LAMP trwy ddulliau lluosog, gan gynnwys fflworoleuedd, electrofforesis gel agarose, neu liwimetreg.Roedd rhwyddineb delweddu a chanfod presenoldeb neu absenoldeb cynnyrch yn ôl lliwimetreg a diffyg offer drud yn golygu bod LAMP yn opsiwn addas ar gyfer profion SARS-CoV-2 mewn ardaloedd lle nad oedd profion labordy clinigol ar gael yn rhwydd, neu storio a chludo samplau. nad oedd yn ymarferol, neu mewn labordai nad oedd ganddynt offer thermocycling PCR o'r blaen.