Credaf y bydd pawb bob amser yn dod ar draws problemau o'r fath neu broblemau o'r fath wrth wneud adweithiau PCR, ond gellir dosbarthu'r rhan fwyaf ohonynt yn ddwy brif broblem:

Rhy ychydig o ymhelaethu ar y templed genyn (mwyhad);
Gormod o ymhelaethu genyn nad yw'n darged.
Mae defnyddio ychwanegion yn un o'r strategaethau cyffredin i ddatrys y problemau hyn.Fel arfer mae dwy agwedd i rôl ychwanegion:
strwythur eilaiddo enynnau (strwythur eilaidd);
Lleihau preimio amhenodol.
Heddiw, bydd y golygydd yn cyflwyno'n fyr yr ychwanegion cyffredin mewn adweithiau PCR a'u swyddogaethau i chi.
Ychwanegion sy'n lleihau strwythur eilaidd
sylocsid(DMSO)
samplau genynnaugyda chynnwys GC uchel.Fodd bynnag, mae DMSO hefyd yn lleihau gweithgaredd Taq polymeras yn fawr.Felly, mae'n rhaid i bawb gydbwyso hygyrchedd y templed a gweithgaredd y polymeras.Mae'r golygydd yn awgrymu y gallwch chi roi cynnig ar wahanol grynodiadau o DSMO, megis o 2% i 10%, i ddod o hyd i'r crynodiad sy'n addas i'ch arbrawf.
Glanedyddion nad ydynt yn ïonig
Mae glanedyddion nad ydynt yn ïonig, megis 0.1-1% Triton X-100, Tween 20 neu NP-40, fel arfer yn lleihau strwythur eilaidd DNA.Er y gall hyn gynyddu ymhelaethiad y genyn templed, bydd hefyd yn achosi'r drafferth o ymhelaethu amhenodol.Felly, mae'r ychwanegion hyn yn gweithio'n dda ar gyfer adweithiau PCR cynnyrch isel heb falurion, ond nid cystal ar gyfer adweithiau PRC cymharol amhur.Mantais arall glanedyddion nad ydynt yn ïonig yw lleihau halogiad SDS.Fel arfer yn ystod y broses echdynnu DNA, bydd SDS yn cael ei ddwyn i'r cam PCR, sy'n atal gweithgaredd y polymeras yn fawr.Felly, gall ychwanegu 0.5% Tween-20 neu Tween-40 i'r adwaith niwtraleiddio effeithiau negyddol SDS.
Betaine_
Gall Betaine wella ymhelaethiad DNA trwy leihau ffurfiant adeiledd eilaidd ac yn gyffredinol mae'n ychwanegiad “dirgel” i gitiau PCR masnachol.Os ydych chi eisiau defnyddio betaine, dylech roi betaine neu betaine mono-hydrate (Betaine neu Betaine mono-hydrate), ond nid hydroclorid betaine (Betaine HCl), addasu i grynodiad terfynol o 1-1.7M.Gall Betaine hefyd helpu i wella penodoldeb oherwydd ei fod yn dileu'r ddibyniaeth cyfansoddiad pâr sylfaen o doddi DNA / dadnatureiddio DNA.
Ychwanegion i leihau preimio amhenodol
Fformamid
Mae formamide yn ychwanegyn PCR organig a ddefnyddir yn gyffredin.Gall gyfuno â rhigol mawr a rhigol leiaf mewn DNA, a thrwy hynny leihau sefydlogrwydd y prif helics DNA dwbl a gostwng tymheredd toddi DNA.Mae crynodiad y formamid a ddefnyddir mewn arbrofion PCR fel arfer yn 1% -5%.
Tetramethylamoniwm clorid( TMAC)
Gall tetramethylammonium clorid gynyddu penodoldeb hybridization (penodoledd hybridization) a chynyddu tymheredd toddi DNA.Felly, gall TMAC ddileu preimio amhenodol a lleihau camrwymo DNA ac RNA.Os ydych yn defnyddiopaent preimio dirywioyn yr adwaith PCR , cofiwch ychwanegu TMAC, a ddefnyddir yn gyffredin ar grynodiad o 15-100mM.
Ychwanegion Cyffredin Eraill
Yn ychwanegol at y ddau gategori o ychwanegion a grybwyllir uchod, mae yna lawer o ychwanegion cyffredin mewn adweithiau PCR, er bod ganddynt swyddogaethau gwahanol, maent hefyd yn bwysig iawn.
Ion magnesiwm
Mae ïon magnesiwm yn cofactor (cofactor) anhepgor o polymeras, hynny yw, heb ïon magnesiwm, mae polymeras yn anactif.Fodd bynnag, gall gormod o ïonau magnesiwm hefyd effeithio ar effeithlonrwydd y polymeras.Bydd crynodiad yr ïonau magnesiwm ym mhob adwaith PCR yn amrywio.Mae cyfryngau chelating (fel EDTA neu sitrad), crynodiad dNTPs a phroteinau i gyd yn effeithio ar grynodiad ïonau magnesiwm.Felly, os ydych chi'n cael problemau gyda'ch arbrawf PCR, gallwch chi geisio newid crynodiadau ïon magnesiwm gwahanol, er enghraifft, o 1.0 i 4.0mM, gyda chyfwng o 0.5-1mM rhyngddynt.
Mae'n werth nodi y gall cylchoedd rhewi-dadmer lluosog arwain at haenu crynodiad yr hydoddiant magnesiwm clorid .Felly, rhaid i chi ei doddi'n llwyr cyn pob defnydd, a'i gymysgu'n dda cyn ei ddefnyddio.
Albwm serwm buchol(albwm buchol, BSA)
Mewn arbrofion cemeg moleciwlaidd, mae albwmin serwm buchol yn ychwanegyn cyffredin iawn, yn enwedig mewn arbrofion treuliad ensymau cyfyngu ac arbrofion PCR.Mewn adweithiau PCR, mae BSA yn ddefnyddiol wrth leihau halogion fel cyfansoddion ffenolig .A dywedir hefyd y gall leihau adlyniad adweithyddion i wal y tiwb prawf.Yn yr adwaith PCR, fel arfer gall y crynodiad o BSA a ychwanegir gyrraedd 0.8 mg/ml.
 
Cynhyrchion Cysylltiedig:
Arwr PCR(gyda lliw)
Arwr PCR