Mewn arbrofion qPCR, mae dylunio paent preimio hefyd yn ddolen bwysig iawn.Mae cysylltiad agos rhwng p'un a yw'r paent preimio yn addas ai peidio ag a yw'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn cyrraedd y safon, a yw'r cynhyrchion chwyddedig yn benodol, ac a yw'r canlyniadau arbrofol ar gael.
Felly sut i wneud penodoldeb preimiwr qPCR yn well?Effeithlonrwydd ymhelaethu uchel?
Heddiw, byddwn yn mynd â chi i ddylunio paent preimio qPCR gyda'n gilydd, a gadael i ddyluniad paent preimio qPCR ddod yn sgil llên effeithlon mewn arbrofion.
Wrth ddylunio paent preimio qPCR, fel arfer rhowch sylw i'r pwyntiau canlynol: dylid dylunio paent preimio ar draws intronau cymaint â phosibl, dylai hyd y cynnyrch fod yn 100-300 bp, dylai'r gwerth Tm fod mor agos â phosibl i 60 ° C, a dylai'r paent preimio i fyny'r afon ac i lawr yr afon fod mor agos â phosibl, a dylai diwedd y paent preimio fod yn G neu C, ac ati.
1. Dyluniad paent preimio yn rhychwantu introns
Wrth ddylunio paent preimio qPCR, gall dewis paent preimio a ddyluniwyd ar draws intronau atal y templed gDNA rhag cael ei chwyddo, ac mae'r cynhyrchion i gyd yn deillio o ymhelaethu cDNA, gan ddileu dylanwad halogiad gDNA.
2. Hyd primer
Mae hyd y paent preimio yn gyffredinol rhwng 18-30 nt, a dylid rheoli hyd y cynnyrch ymhelaethu rhwng 100-300 bp cymaint â phosibl.
Os yw'r paent preimio yn rhy fyr, bydd yn arwain at ymhelaethu amhenodol, ac os yw'n rhy hir, bydd yn hawdd ffurfio strwythur eilaidd (fel strwythur pin gwallt).Os yw'r cynnyrch ymhelaethu yn rhy hir, nid yw'n addas ar gyfer adwaith polymeras, a fydd yn effeithio ar effeithlonrwydd ymhelaethu PCR.
3. Cynnwys GC a gwerth Tm
Dylid rheoli cynnwys GC paent preimio rhwng 40% a 60%.Os yw'n rhy uchel neu'n rhy isel, nid yw'n ffafriol i gychwyn yr adwaith.Dylai cynnwys GC y preimwyr blaen a gwrthdroi fod yn agos at yr un peth er mwyn cael yr un gwerth Tm a thymheredd anelio.
Dylai'r gwerth Tm fod rhwng 55-65°C cyn belled ag y bo modd, yn gyffredinol tua 60°C, a dylai gwerth Tm yr afon i fyny ac i lawr yr afon fod mor agos â phosibl, o ddewis dim mwy na 4°C.
4. Ceisiwch osgoi dewis A ar ddiwedd 3′ y paent preimio
Pan nad yw pen 3′ y paent preimio yn cyfateb, mae gwahaniaethau mawr yn effeithlonrwydd synthesis gwahanol seiliau.Pan fydd y sylfaen olaf yn A, gall hefyd gychwyn synthesis cadwyn hyd yn oed yn achos diffyg cyfatebiaeth, a phan fydd y sylfaen olaf yn T Pryd , mae effeithlonrwydd sefydlu diffyg cyfatebiaeth yn cael ei leihau'n fawr.Felly, ceisiwch osgoi dewis A ar ddiwedd 3′ y paent preimio, ac mae'n well dewis T.
Os mai paent preimio stiliwr ydyw, ni all pen 5′ y stiliwr fod yn G, oherwydd hyd yn oed pan fydd un sylfaen G wedi'i gysylltu â grŵp gohebwyr fflworoleuol FAM, gall G hefyd ddiffodd y signal fflwroleuol a allyrrir gan y grŵp FAM, gan arwain at ganlyniadau negyddol ffug.Ymddangos.
5. Dosbarthiad sylfaen
Mae dosbarthiad y pedwar gwaelod yn y preimiwr yn ddewisol ar hap, gan osgoi mwy na 3 G neu C yn olynol ar y pen 3′, a mwy na 3 yn olynolMae G neu C yn hawdd i gynhyrchu paru yn y rhanbarth dilyniant cyfoethog GC.
6. Dylai'r rhanbarth dylunio paent preimio osgoi strwythurau eilaidd cymhleth.
Bydd y strwythur eilaidd a ffurfiwyd gan un llinyn y cynnyrch ymhelaethu yn effeithio ar gynnydd llyfn PCR.Trwy ragfynegi a oes strwythur eilaidd yn y dilyniant targed ymlaen llaw, ceisiwch osgoi'r rhanbarth hwn wrth ddylunio paent preimio.
7. Dylai'r paent preimio eu hunain a rhwng y paent preimio geisio osgoi seiliau cyflenwol olynol.
Ni all fod cyfatebolrwydd 4 sylfaen olynol rhwng y paent preimio ei hun a'r paent preimio.Ni ddylai fod gan y paent preimio ei hun ddilyniant cyflenwol, fel arall bydd yn plygu ei hun i ffurfio strwythur hairpin, a fydd yn effeithio ar gyfuniad anelio'r paent preimio a'r templed.
Ni all dilyniannau cyflenwol fodoli rhwng preimwyr i fyny'r afon ac i lawr yr afon.Bydd cydweddoldeb rhwng paent preimio yn cynhyrchu dimers preimio, a fydd yn lleihau effeithlonrwydd PCR a hyd yn oed yn effeithio ar gywirdeb meintiol.Os nad oes modd osgoi'r strwythurau paent preimio a phin gwallt, ni ddylai'r gwerth △G fod yn rhy uchel (dylai fod yn llai na 4.5 kcal/mol).
8. Mae'r paent preimio yn chwyddo'r cynnyrch targed penodol.
Nod canfod qPCR yn y pen draw yw deall helaethrwydd y genyn targed.Os bydd ymhelaethu amhenodol yn digwydd, bydd y meintioliad yn anghywir.Felly, ar ôl i'r paent preimio gael ei ddylunio, mae angen eu profi gan BLAST, a chymharir penodoldeb y cynhyrchion yn y gronfa ddata dilyniant.
Nesaf, rydym yn cymryd y genyn GAS6 dynol (Arestiad twf 6 penodol) fel enghraifft i ddylunio paent preimio qPCR.
01 genyn ymholiad
Homo GAS6trwy NCBI .Yma, dylem dalu sylw i gymharu enw'r genyn a'r rhywogaeth i sicrhau eu bod yn gyson.
02 Darganfyddwch y dilyniant genynnau
(1) Os DNA genomig yw'r dilyniant targed, dewiswch yr un cyntaf, sef dilyniant DNA genomig y genyn.
(2) Os mRNA yw'r dilyniant targed, dewiswch yr ail un.Ar ôl mynd i mewn, cliciwch "CDS" yn y tabl isod.Y dilyniant cefndir brown yw dilyniant codio'r genyn.
03 Dylunio paent preimio
Rhowch y rhyngwyneb Primer-BLAST
Rhowch y rhif dilyniant genyn neu'r dilyniant mewn fformat Fasta ar y chwith uchaf, a llenwch y paramedrau perthnasol.

Cliciwch “Get primers” a bydd NCBI yn ymddangos i ddweud wrthych y bydd dewis paramedr o'r fath yn cael ei ymhelaethu i amrywiadau splicing eraill.Gallwn wirio'r gwahanol amrywiadau splicing a'u cyflwyno i gael y pâr preimio priodol (fel y dangosir yn y ffigur isod ).Gall y broses hon gymryd degau o eiliadau i redeg.
Mae tymereddau anelio'r parau preimio hyn i gyd tua 60°C.Yn ôl pwrpas yr arbrawf, dewiswch paent preimio gyda hyd cymedrol, penodoldeb da a llai o hunan-gyflenwi'r paent preimio ar gyfer yr arbrawf, ac mae'r gyfradd llwyddiant yn eithaf uchel!
04 Gwiriad penodolrwydd cysefin
Mewn gwirionedd, yn ogystal â dylunio paent preimio, gall Primer-Blast hefyd werthuso'r paent preimio a ddyluniwyd gennym ni ein hunain.Dychwelwch i'r dudalen dylunio paent preimio, nodwch y paent preimio i fyny'r afon ac i lawr yr afon a ddyluniwyd gennym, ac ni fydd paramedrau eraill yn cael eu haddasu.Ar ôl cyflwyno, gallwch weld a yw'r pâr o preimio hefyd yn bodoli ar enynnau eraill.Os yw pob un ohonynt yn cael eu harddangos ar y genyn rydym am ymhelaethu , gan nodi bod penodoldeb y pâr hwn o preimwyr yn wych!(Er enghraifft, dyma unig ganlyniad yr ymholiad preimio!)

05 Barn ansawdd gysefin
Pa fath o paent preimio yw'r paent preimio “perffaith” sy'n cyfuno “effeithlonrwydd mwyhau hyd at y safon”, “nodweddion cynnyrch chwyddedig”, a “chanlyniadau arbrofol dibynadwy”?
Effeithlonrwydd ymhelaethu

cromlin toddi
Mae effeithlonrwydd ymhelaethu'r paent preimio yn cyrraedd 90% -110%, sy'n golygu bod yr effeithlonrwydd ymhelaethu yn dda, ac mae gan y gromlin doddi un brig ac fel arfer Tm> 80 ° C, sy'n golygu bod y penodolrwydd ymhelaethu yn dda.
 
Cynhyrchion Cysylltiedig:
Amser Real PCR Hawdd – SYBR GWYRDD I
Amser Real PCR Hawdd-Taqman