Mae technoleg diagnosis moleciwlaidd yn defnyddio dulliau bioleg moleciwlaidd i ganfod mynegiant a strwythur deunydd genetig y corff dynol a phathogenau amrywiol, er mwyn cyflawni pwrpas rhagfynegi a diagnosio afiechydon.

Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, gydag uwchraddio ac iteriad technoleg diagnostig moleciwlaidd, mae cymhwysiad clinigol diagnosteg moleciwlaidd wedi dod yn fwy a mwy helaeth a manwl, ac mae'r farchnad diagnosteg moleciwlaidd wedi mynd i gyfnod o ddatblygiad cyflym.

Mae'r awdur yn crynhoi'r technolegau diagnostig moleciwlaidd cyffredin ar y farchnad, ac fe'i rhennir yn dair rhan: mae'r rhan gyntaf yn cyflwyno'r dechnoleg PCR, mae'r ail ran yn cyflwyno technoleg mwyhau isothermol asid niwclëig, ac mae'r ail ran yn cyflwyno'r dechnoleg dilyniannu.

01

Rhan I: Technoleg PCR

Technoleg PCR

Mae PCR (adwaith cadwyn polymeras) yn un o'r technolegau mwyhau DNA in vitro, gyda hanes o fwy na 30 mlynedd.

Arloeswyd technoleg PCR ym 1983 gan Kary Mullis o Cetus, UDA.Ymgeisiodd Mullis am batent PCR ym 1985 a chyhoeddodd y papur academaidd PCR cyntaf ar Wyddoniaeth yn yr un flwyddyn.Enillodd Mullis y Wobr Nobel mewn Cemeg yn 1993.

Egwyddorion Sylfaenol PCR

Gall PCR chwyddo darnau DNA targed fwy na miliwn o weithiau.Yr egwyddor yw, o dan gatalysis DNA polymeras, bod y rhiant llinyn DNA yn cael ei ddefnyddio fel templed, a defnyddir paent preimio penodol fel man cychwyn ar gyfer estyniad.Mae'n cael ei ailadrodd in vitro trwy gamau fel dadnatureiddio, anelio ac ymestyn.Y broses o DNA llinyn merch yn ategu'r templed DNA llinyn rhiant.

Rhennir y broses PCR safonol yn dri cham:

1. Dadnatureiddio: Defnyddiwch dymheredd uchel i wahanu llinynnau dwbl DNA.Mae'r bondiau hydrogen rhwng llinynnau dwbl DNA yn cael eu torri ar dymheredd uchel (93-98°C).

2. Anelio: Ar ôl i'r DNA llinyn dwbl gael ei wahanu, mae'r tymheredd yn cael ei ostwng fel bod y paent preimio yn gallu rhwymo i'r DNA un llinyn.

3. Estyniad: Mae'r DNA polymeras yn dechrau syntheseiddio llinynnau cyflenwol ar hyd y llinynnau DNA o'r preimwyr sydd wedi'u rhwymo pan fydd y tymheredd yn cael ei ostwng.Pan gwblheir yr estyniad, cwblheir cylchred, ac mae nifer y darnau DNA yn dyblu.

Gan ail-wneud y tri cham hyn 25-35 gwaith, bydd nifer y darnau DNA yn cynyddu'n esbonyddol.

Dyfeisgarwch PCR yw y gellir dylunio paent preimio gwahanol ar gyfer gwahanol enynnau targed, fel y gellir chwyddo'r darnau genyn targed mewn cyfnod byr o amser.

Hyd yn hyn, gellir rhannu PCR yn dri chategori, sef PCR cyffredin, PCR meintiol fflwroleuol a PCR digidol.

Y genhedlaeth gyntaf o PCR cyffredin

Defnyddiwch offeryn ymhelaethu PCR cyffredin i ymhelaethu ar y genyn targed, ac yna defnyddiwch electrofforesis gel agarose i ganfod y cynnyrch, dim ond dadansoddiad ansoddol y gellir ei wneud.

Prif anfanteision PCR cenhedlaeth gyntaf:

-Yn dueddol o ymhelaethu amhenodol a chanlyniadau positif ffug.

-Mae'r canfod yn cymryd amser hir ac mae'r llawdriniaeth yn feichus.

-Dim ond profion ansoddol y gellir eu gwneud.

PCR meintiol fflworoleuedd ail genhedlaeth

Defnyddir PCR meintiol fflworoleuedd (PCR Amser Real), a elwir hefyd yn qPCR, i fonitro cronni cynhyrchion chwyddedig trwy grynhoad signalau fflwroleuol trwy ychwanegu stilwyr fflwroleuol a all nodi cynnydd y system adwaith, ac i farnu'r canlyniadau trwy'r gromlin fflworoleuedd, a gellir ei fesur gyda chymorth cromlin safonol a gwerth safonol Cq.

Oherwydd bod y dechnoleg qPCR yn cael ei chynnal mewn system gaeedig, mae'r tebygolrwydd o halogiad yn cael ei leihau, a gellir monitro'r signal fflworoleuedd ar gyfer canfod meintiol, felly dyma'r un a ddefnyddir fwyaf mewn ymarfer clinigol ac mae wedi dod yn dechnoleg amlycaf yn PCR.

Gellir rhannu'r sylweddau fflwroleuol a ddefnyddir mewn PCR meintiol fflwroleuol amser real yn: stilwyr fflworoleuol TaqMan, goleuadau moleciwlaidd a llifynnau fflwroleuol.

1) chwiliwr fflworoleuol TaqMan:

Yn ystod ymhelaethiad PCR, ychwanegir stiliwr fflwroleuol penodol wrth ychwanegu pâr o preimwyr.Mae'r stiliwr yn oligonucleotid, ac mae'r ddau ben wedi'u labelu yn y drefn honno â grŵp fflworoleuol gohebydd a grŵp fflworoleuol quencher.

Pan fydd y stiliwr yn gyfan, mae'r signal fflwroleuol a allyrrir gan y grŵp adrodd yn cael ei amsugno gan y grŵp diffodd;yn ystod ymhelaethu PCR, mae gweithgaredd exonuclease 5′-3′ o ensym Taq yn hollti ac yn diraddio'r chwiliwr, gan wneud y grŵp fflwroleuol gohebydd a quencher Mae'r grŵp fflwroleuol yn cael ei wahanu, fel bod y system monitro fflworoleuedd yn gallu derbyn y signal fflworoleuedd, hynny yw, bob tro mae llinyn DNA yn cael ei chwyddo, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n llwyr, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n llwyr, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n llwyr, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n gyfan gwbl, ac mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n gyfan gwbl. gyda ffurfio'r cynnyrch PCR.

2) llifynnau fflwroleuol SYBR:

Yn y system adwaith PCR, ychwanegir gormodedd o liw fflwroleuol SYBR.Ar ôl i'r llifyn fflwroleuol SYBR gael ei ymgorffori'n amhenodol yn y llinyn dwbl DNA, mae'n allyrru signal fflwroleuol.Ni fydd y moleciwl lliw SYBR nad yw wedi'i ymgorffori yn y gadwyn yn allyrru unrhyw signal fflwroleuol, a thrwy hynny sicrhau'r signal fflwroleuol Mae'r cynnydd mewn cynhyrchion PCR wedi'i gydamseru'n llwyr â'r cynnydd mewn cynhyrchion PCR.Mae SYBR yn rhwymo i DNA dwbl yn unig, felly gellir defnyddio'r gromlin doddi i benderfynu a yw'r adwaith PCR yn benodol.

3) Bannau moleciwlaidd

Mae'n stiliwr oligonucleotid label-dwbl dolen goes sy'n ffurfio strwythur pin gwallt o tua 8 gwaelod yn y 5 a 3 pen.Mae'r dilyniannau asid niwclëig ar y ddau ben yn cael eu paru'n gyflenwol, gan achosi i'r grŵp fflwroleuol a'r grŵp diffodd fod yn dynn.Yn agos, ni fydd yn cynhyrchu fflworoleuedd.

Ar ôl i'r cynnyrch PCR gael ei gynhyrchu, yn ystod y broses anelio, mae rhan ganol y beacon moleciwlaidd yn cael ei baru â dilyniant DNA penodol, ac mae'r genyn fflwroleuol yn cael ei wahanu oddi wrth y genyn quencher i gynhyrchu fflworoleuedd.

Prif anfanteision PCR ail genhedlaeth:

Mae sensitifrwydd yn dal i fod yn ddiffygiol, ac nid yw canfod sbesimenau copi isel yn gywir.

Mae dylanwad gwerth cefndirol, ac mae'r canlyniad yn agored i ymyrraeth.

PCR digidol trydedd genhedlaeth

Mae PCR Digidol (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) yn cyfrifo rhif copi y dilyniant targed trwy ganfod diweddbwynt, a gall berfformio canfod meintiol absoliwt cywir heb ddefnyddio rheolaethau mewnol a chromliniau safonol.

Mae PCR digidol yn defnyddio canfod diweddbwynt ac nid yw'n dibynnu ar y gwerth Ct (trothwy beicio), felly mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn effeithio'n llai ar yr adwaith PCR digidol, ac mae'r goddefgarwch i atalyddion adwaith PCR yn cael ei wella, gyda chywirdeb uchel ac atgynhyrchedd.

Oherwydd nodweddion sensitifrwydd uchel a chywirdeb uchel, nid yw atalyddion adwaith PCR yn ymyrryd yn hawdd, a gall gyflawni meintioliad gwirioneddol absoliwt heb gynhyrchion safonol, sydd wedi dod yn fan cychwyn ymchwil a chymhwyso.

Yn ôl gwahanol ffurfiau'r uned adwaith, gellir ei rannu'n dri math: systemau microfluidig, sglodion a defnynnau.