Gwerth Ct yw'r ffurf cyflwyno canlyniad pwysicaf o PCR meintiol fflwroleuol.Fe'i defnyddir i gyfrifo gwahaniaethau mynegiant genynnau neu rif copi genynnau.Felly beth yw gwerth Ct meintioli fflworoleuedd yn cael ei ystyried yn rhesymol?Sut i sicrhau'r ystod effeithiol o werth Ct?
Beth yw Gwerth Ct?
Yn ystod y broses ymhelaethu qPCR, y nifer cyfatebol o gylchoedd ymhelaethu (Trothwy Beic) pan fydd signal fflworoleuedd y cynnyrch chwyddedig yn cyrraedd y trothwy fflworoleuedd a osodwyd.Ystyr C yw Cycle a T yw Trothwy.Yn syml, y gwerth Ct yw nifer y cylchoedd sy'n cyfateb i pan fydd ymhelaethiad templed cychwynnol yn cyrraedd swm penodol o gynnyrch yn qPCR.Bydd yr hyn a elwir yn “swm penodol o gynnyrch” yn cael ei esbonio ymhellach yn nes ymlaen.
Beth mae gwerth Ct yn ei wneud?
1.Perthynas rhwng ymhelaethu esbonyddol, swm y templed a gwerth Ct
Yn ddelfrydol, mae genynnau mewn qPCR yn cael eu cronni trwy ymhelaethu esbonyddol ar ôl nifer penodol o gylchoedd.Y berthynas rhwng nifer y cylchoedd ymhelaethu a nifer y cynhyrchion yw: Swm cynnyrch chwyddedig = swm templed cychwynnol × (1+En) rhif cylchoedd.Fodd bynnag, nid yw'r adwaith qPCR bob amser mewn sefyllfa ddelfrydol.Pan fydd swm y cynnyrch chwyddedig yn cyrraedd "swm cynnyrch penodol", nifer y cylchoedd ar hyn o bryd yw'r gwerth Ct, ac mae yn y cyfnod ymhelaethu esbonyddol.Y berthynas rhwng y gwerth Ct a maint y templed cychwynnol: Mae perthynas linellol rhwng gwerth Ct y templed a logarithm rhif copi cychwynnol y templed.Po uchaf yw'r crynodiad templed cychwynnol, y lleiaf yw'r gwerth Ct;po isaf yw'r crynodiad templed cychwynnol, y mwyaf yw'r gwerth Ct.
Cromlin 2.Amplification, trothwy fflworoleuedd a swm penodol o gynnyrch PCR
Mae swm y cynnyrch ymhelaethu qPCR yn cael ei gyflwyno'n uniongyrchol ar ffurf signal fflwroleuol, hynny yw, y gromlin ymhelaethu.Yng nghyfnod cynnar PCR, mae'r ymhelaethiad o dan amodau delfrydol, mae nifer y cylchoedd yn fach, mae'r casgliad cynnyrch yn fach, ac ni ellir gwahaniaethu'n glir rhwng lefel y fflworoleuedd a'r cefndir fflworoleuedd.Ar ôl hynny, mae'r fflworoleuedd yn cynyddu ac yn mynd i mewn i'r cyfnod esbonyddol.Gellir canfod maint y cynnyrch PCR ar adeg benodol pan fo'r adwaith PCR yn y cyfnod esbonyddol yn unig, y gellir ei ddefnyddio fel "swm penodol o gynnyrch", a gellir didynnu cynnwys cychwynnol y templed o hyn.Felly, dwyster y signal fflworoleuedd sy'n cyfateb i swm penodol o gynnyrch yw'r trothwy fflworoleuedd.
Yn ystod cam hwyr PCR, nid yw'r gromlin ymhelaethu bellach yn dangos ymhelaethiad esbonyddol, ac yn mynd i mewn i'r cyfnod llinol a'r cyfnod llwyfandir.
3.Reproducibility o werthoedd Ct
Pan fydd y cylch PCR yn cyrraedd rhif cylch y gwerth Ct, mae newydd fynd i mewn i'r gwir gyfnod ymhelaethu esbonyddol.Ar yr adeg hon, nid yw'r gwall bach wedi'i chwyddo, felly mae atgynhyrchedd gwerth Ct yn ardderchog, hynny yw, mae'r un templed yn cael ei chwyddo ar wahanol adegau neu mewn tiwbiau gwahanol ar yr un pryd.Ymhelaethiad, mae'r gwerth Ct a gafwyd yn gyson.
Effeithlonrwydd 1.Amplification En
Mae effeithlonrwydd ymhelaethu PCR yn cyfeirio at yr effeithlonrwydd y mae'r polymeras yn trosi'r genyn i'w chwyddo'n amplicon.Yr effeithlonrwydd mwyhau pan fydd un moleciwl DNA yn cael ei drawsnewid yn ddau foleciwl DNA yw 100%.Mae effeithlonrwydd ymhelaethu yn cael ei fynegi'n gyffredin fel En.Er mwyn hwyluso'r dadansoddiad o erthyglau dilynol, cyflwynir y ffactorau sy'n effeithio ar effeithlonrwydd ymhelaethu yn fyr.
| Ffactorau sy'n dylanwadu | esboniad | Sut i farnu? |
| A. atalyddion PCR | 1. Mae'r templed DNA yn cynnwys sylweddau sy'n atal yr adwaith PCR, fel proteinau neu lanedyddion.2. Mae'r cDNA ar ôl trawsgrifio gwrthdro yn cynnwys crynodiad uchel o dempled RNA neu gydrannau adweithydd RT, a allai hefyd atal yr adwaith PCR dilynol. | 1. Gellir barnu a oes llygredd trwy fesur cymhareb A260/A280 ac A260/A230 neu electrofforesis RNA.2. A yw'r cDNA yn cael ei wanhau yn ôl cymhareb benodol ar ôl trawsgrifio gwrthdro. |
| B. Dyluniad paent preimio amhriodol | Nid yw preimio yn anelio'n effeithlon | Gwiriwch y paent preimio am dimers paent preimio neu biniau gwallt, anghysondebau, ac weithiau'n rhychwantu dyluniadau cynhenid. |
| C. Dyluniad rhaglen adwaith PCR amhriodol | 1. Ni all preimio anelio'n effeithiol2. Rhyddhad annigonol o DNA polymeras 3. Gostyngodd gweithgaredd polymeras DNA tymheredd uchel hirdymor | 1. Mae'r tymheredd anelio yn uwch na gwerth TM y paent preimio2. Mae amser cyn dadnatureiddio yn rhy fyr 3. Mae amser pob cam o'r weithdrefn adwaith yn rhy hir |
| D. Cymysgu adweithyddion neu wallau pibio yn annigonol | Yn y system adwaith, mae'r crynodiad lleol o gydrannau adwaith PCR yn rhy uchel neu'n anwastad, gan arwain at ymhelaethu ar ymhelaethiad PCR nad yw'n esbonyddol. | |
| E. Hyd Amplicon | Mae hyd yr aplicon yn rhy hir, yn fwy na 300bp, ac mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn isel | Gwiriwch fod hyd yr amplicon rhwng 80-300bp |
| F. Dylanwad adweithyddion qPCR | Mae crynodiad DNA polymeras yn yr adweithydd yn isel neu nid yw crynodiad yr ïonau yn y byffer wedi'i optimeiddio, gan olygu nad yw gweithgaredd yr ensymau Taq yn cyrraedd yr uchafswm | Pennu effeithlonrwydd ymhelaethu yn ôl cromlin safonol |
2.Range o werthoedd Ct
Mae gwerthoedd Ct yn amrywio o 15-35.Os yw'r gwerth Ct yn llai na 15, ystyrir bod yr ymhelaethiad o fewn ystod y cyfnod gwaelodlin ac nid yw'r trothwy fflworoleuedd wedi'i gyrraedd.Yn ddelfrydol, mae perthynas llinol rhwng y gwerth Ct a logarithm rhif copi cychwynnol y templed, hynny yw, y gromlin safonol.Trwy'r gromlin safonol, pan fo'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn 100%, mae'r gwerth Ct wedi'i gyfrifo ar gyfer meintioli rhif copi sengl y genyn tua 35. Os yw'n fwy na 35, mae rhif copi cychwynnol y templed yn ddamcaniaethol yn llai nag 1, y gellir ei ystyried yn ddiystyr.
Ar gyfer gwahanol ystodau Ct genyn, oherwydd y gwahaniaeth mewn rhif copi genyn ac effeithlonrwydd ymhelaethu yn y swm templed cychwynnol, mae angen gwneud cromlin safonol ar gyfer y genyn a chyfrifo ystod canfod llinellol y genyn.
3.Ffactorau dylanwadol o werth Ct
O'r berthynas rhwng nifer y cylchoedd ymhelaethu a swm y cynnyrch: swm y cynnyrch chwyddedig = swm y templed cychwynnol × (1+En) nifer y cylch, gellir gweld, o dan amodau delfrydol, y bydd maint y templed cychwynnol ac En yn cael effaith negyddol ar werth Ct.Bydd y gwahaniaeth mewn ansawdd templed neu effeithlonrwydd ymhelaethu yn achosi i'r gwerth Ct fod yn rhy fawr neu'n rhy fach.
Mae gwerth 4.Ct yn rhy fawr neu'n rhy fach
Amser post: Chwefror-22-2023
