RT-qPCR yw arbrawf sylfaenol bioleg moleciwlaidd, a rhaid i bawb fod yn gyfarwydd ag ef.Mae'n cynnwys tri cham yn bennaf: echdynnu RNA, trawsgrifio gwrthdro i cDNA, a PCR meintiol fflwroleuol amser real.Nid yw'n helpu, beth sy'n digwydd?Mae’n debyg bod problem gydayr arbrawf trawsgrifio o chwith!Er ei bod yn ymddangos bod angen i'r arbrawf trawsgrifio cefn ond ychwanegu RNA, dNTP, paent preimio, atrawsgrifiad gwrthdroi'r tiwb centrifuge a chymysgu'n dda, ond yn y broses weithredu wirioneddol, mae yna lawer o fanylion o hyd y mae angen rhoi sylw iddynt.Gadewch i ni ddysgu amdano!

Sut i farnu ansawdd RNA?
I gael cDNA, mae ansawdd RNA yn hollbwysig!Gellir canfod ansawdd RNA yn bennaf o ddwy agwedd:
(1) uniondeb RNA:Gellir gwirio uniondeb RNA gan electrofforesis gel agarose. Gan gymryd ewcaryotau fel enghraifft, mae gan gyfanswm cyflawn RNA dri band clir, y pwysau moleciwlaidd o fawr i fach yw 28S, 18S, a 5S, ac mae 28S ddwywaith mor llachar â 18S;os gellir gweld tri band, ond mae'r math o fand yn aneglur neu mae Trylediad yn golygu bod yr RNA wedi'i ddiraddio'n rhannol.Ar yr adeg hon, gwnewch yr adwaith trawsgrifio gwrthdro ar unwaith a chynyddwch y mewnbwn templed yn briodol;os mai dim ond band â phwysau moleciwlaidd bach neu ddim band y gellir ei weld, mae'r RNA wedi'i ddiraddio'n llwyr ac mae angen ei ail-echdynnu.Mae Agilent 2100 yn dynodi cyfanrwydd RNA gyda diagram brig a gwerth RIN.Os yw'r asid niwclëig yn gyfan, mae llinell sylfaen yr electrofferogram yn wastad;os yw'r asid niwclëig wedi'i ddiraddio'n ddifrifol, mae'r llinell sylfaen yn anwastad ac mae mwy o gopaon diraddio yn ymddangos;mae gwerth RIN yn adlewyrchu uniondeb yr RNA, o fewn yr ystod o 0-10, po fwyaf yw'r gwerth, y gorau yw ansawdd yr RNA.Wel, po uchaf y cyflawnder.
(2) Purdeb RNA:Gellir canfod y gymhareb OD260/280 gan sbectrophotometreg UV.Os yw'r gymhareb OD260/280 rhwng 1.9 a 2.1, mae'r purdeb yn dda iawn.
Gall DNA genomig gweddilliol arwain at ganlyniadau meintiol anghywir
Pan dynnir RNA, mae'n bosibl y bydd yr RNA a gawn yn cael ei gymysgu â DNA genomig (gDNA) nad yw wedi'i lanhau.Felly, bydd y cDNA ar ôl trawsgrifio o chwith hefyd yn cael ei gymysgu âgDNA.Yn ystod y lawr yr afonqPCRadwaith,cDNAa gall gDNA gael ei chwyddo ar yr un pryd, gan arwain at werth CT cymharol fach, felly gall y canlyniadau fod yn unochrog.
Felly beth ddylem ni ei wneud yn y sefyllfa hon?Foregeneyn awgrymu:
(1) Perfformio glanhau genom ar yr RNA gwrthdroi, y gellir ei dynnu trwy echdynnu colofn yn ystod echdynnu RNA;
(2) Triniwch yr RNA a echdynnwyd gyda DNAI , ond ei derfynu gyda EDTA;
o adweithyddion trawsgrifio gwrthdrogyda modiwlau clirio genomau;

Sut i ddewis paent preimio ar gyfer trawsgrifio o chwith?
Mae paent preimio trawsgrifio gwrthdro hefyd yn effeithio ar ganlyniad yr adwaith trawsgrifio gwrthdro.Gallwch ddewis paent preimio ar hap, Oligo dT neu preimwyr genyn-benodol ar gyfer trawsgrifio o chwith yn ôl amgylchiadau penodol yr arbrawf:
(1) Trawsgrifiadau penodol: argymhellir preimio genyn-benodol;
(2) Trawsgrifiadau darn hirArgymhellir : Oligo dT/preimwyr genyn-benodol;
(3) Darnau mewnol o drawsgrifiadau segment hir: preimio genyn-benodol / paent preimio ar hap / paent preimio ar hap + Oligo dT.Os perfformir yr arbrawf qPCR dilynol, ni ellir defnyddio Oligo dT ar ei ben ei hun, oherwydd gall defnyddio Oligo dT yn unig achosi gogwydd diwedd 3′, gan arwain at ganlyniadau arbrawf qPCR anghywir;
(4) miRNA: Gellir defnyddio paent preimio bôn-dolen neu breimwyr sorod.

Sawl gwaith y dylid gwanhau'r cynnyrch trawsgrifio cefn cDNA ar gyfer meintioli?
Ar ôl cael cDNA y cynnyrch trawsgrifio gwrthdro, mae sawl gwaith y dylid gwanhau'r cDNA ar gyfer arbrofion qPCR yn bwysig iawn.Os yw'r crynodiad cDNA yn rhy uchel neu'n rhy isel, efallai y bydd yr effeithlonrwydd ymhelaethu yn cael ei effeithio.A ellir mesur y crynodiad cDNA, a sut y dylid ei wneud?
(1) Ni ellir mesur crynodiad cDNA y cynnyrch trawsgrifio gwrthdro, oherwydd yn ogystal â'r cynnyrch cDNA, mae'r cynnyrch trawsgrifio gwrthdro hefyd yn cynnwys Clustogiad gweddilliol trawsgrifio gwrthdro, trawsgrifiad gwrthdro, paent preimio, ac ati, a fydd yn ymyrryd â'r canlyniadau mesur crynodiad ac yn achosi cymhareb OD260/280, OD260/230 annormal ac felly nid yw'n adlewyrchu gwir gymhareb cDNA.Ar yr adeg hon, bydd rhai ffrindiau'n dweud, yna byddaf yn mesur y crynodiad ar ôl puro;yma, hoffai Foregene atgoffa nad yw'r cDNA yn cael ei argymell i gael ei buro, oherwydd bod hyd y cDNA a geir trwy'r gwrthdroad yn wahanol, a bydd y cDNA byr yn cael ei golli yn y puro.
(2) Felly beth i'w wneud?Cyn yr arbrawf qPCR, gellir pennu graddiant gwanhau'r cDNA trwy'r cyn-arbrawf .Er enghraifft: defnyddio datrysiad stoc cDNA, gwanhau 10-plyg, a gwanhau 100-plyg fel templedi ar gyfer arbrofion qPCR, a dewiswch y ffactor gwanhau sydd â gwerth CT yn yr ystod o 18-28.

Sut y dylid trawsgrifio miRNAs o chwith?
Mae miRNA yn RNA moleciwl bach un edefyn gyda maint o tua 22 nt nad yw'n codio ar gyfer protein.Oherwydd ei hyd byr, mae dull confensiynol qPCR yn anodd ei fesur yn uniongyrchol, felly mae angen ymestyn miRNA yn aml;mae'r dulliau trawsgrifio cefn a ddefnyddir yn gyffredin ar gyfer miRNA yn cynnwys dull dolen goesyn a dull cynffonnau.
Y dull dolen bonyn yw ymestyn y miRNA drwy ychwanegu paent preimio coes-dolen.Mae gan y dull canfod hwn sensitifrwydd a phenodoldeb uwch, ond mae'r trwybwn canfod yn isel.Dim ond un miRNA a chyfeiriad mewnol y gall un trawsgrifiad o'r cefn ei ganfod;mae'r dull ychwanegu cynffon yn cynnwys dau Mae'n cael ei gwblhau gan weithred ar y cyd dau ensym, sef PolyA polymeras a gwrthdroi transcriptase.PolyA polymeras sy'n gyfrifol am ychwanegu cynffonau PolyA i miRNA i gynyddu ei hyd, ac mae transcriptase gwrthdro yn perfformio adwaith trawsgrifio gwrthdro.Mae gan y dull hwn trwybwn canfod uchel a gall ganfod miRNAs lluosog a chyfeiriadau mewnol mewn un trawsgrifiad gwrthdro, ond mae'r sensitifrwydd a'r penodoldeb yn isel yn y dull dolen bonyn.