PCR, lluosog PCR, PCR yn y fan a'r lle, Gwrthdroi PCR, RT-PCR, qPCR (1)-PCR

Byddwn yn rhoi trefn ar gysyniadau, camau a manylion amrywiol PCR

Ⅰ. PCR

Mae Adwaith Cadwyn Polymerase, y cyfeirir ato fel PCR, yn dechnoleg fiolegol moleciwlaidd a ddefnyddir i ehangu darnau DNA penodol.Gellir ei ystyried yn atgynhyrchiad DNA arbennig in vitro.Darganfuwyd DNA polymerase (DNA Polymerase I) mor gynnar â 1955, a darganfuwyd Klenow Fragment of E. Coli, sydd â gwerth arbrofol ac ymarferoldeb, gan Dr H. Klenow yn gynnar yn y 1970au, ond oherwydd nad yw'r ensym hwn yn goddef tymheredd, gall tymheredd uchel ei ddirywio, felly nid yw'n cwrdd â'r adwaith cadwyn degenhedlu polymeras â thymheredd uchel.Cafodd yr ensymau sy'n cael eu defnyddio heddiw (a elwir yn Taq polymerase), eu hynysu o Thermus aquaticus, bacteriwm gwanwyn poeth ym 1976. Ei nodwedd yw y gall wrthsefyll tymheredd uchel ac mae'n ensym delfrydol, ond fe'i defnyddir yn helaeth ar ôl y 1980au.Mae cysyniad gwreiddiol y prototeip cyntefig gwreiddiol o PCR yn debyg i atgyweirio a chopïo genynnau, a gynigiwyd gan Dr. KJell Kleppe ym 1971. Cyhoeddodd y copi genyn syml a thymor byr cyntaf (yn debyg i ddau adwaith cylch cyntaf PCR).Datblygwyd y PCR a ddatblygwyd heddiw gan Dr. Kary B. Mullis ym 1983. Gwasanaethodd Dr Mullis gwmnïau Addysg Gorfforol y flwyddyn honno, felly mae gan AG statws arbennig yn y diwydiant PCR.Cyhoeddodd Dr. Mullis y papur cysylltiedig cyntaf gyda Saiki ac eraill yn swyddogol ym 1985. Ers hynny, mae'r defnydd o PCR yn filoedd o filltiroedd y dydd, a gellir dweud bod ansawdd y papurau cysylltiedig yn gwneud llawer o ddulliau ymchwil eraill yn annymunol.Yn dilyn hynny, defnyddir technoleg PCR yn eang mewn ymchwil wyddonol fiolegol a chymwysiadau clinigol, gan ddod yn dechnoleg bwysicaf ymchwil bioleg moleciwlaidd.Enillodd Mullis hefyd Wobr Nobel 1993 mewn Cemeg.

PCREgwyddor

Mae egwyddor sylfaenol technoleg PCR yn debyg i broses ddyblygu naturiol DNA, ac mae ei benodolrwydd yn dibynnu ar y paent preimio oligonucleotid sy'n ategu dau ben y dilyniant targed.Mae PCR yn cynnwys dirywiad-anelio-ymestyn tri cham adwaith sylfaenol: ①Dirywiad DNA templed: Ar ôl i'r DNA templed gael ei gynhesu i tua 93 ° C am gyfnod penodol o amser, mae'r datrysiad DNA deuol ar gyfer y DNA cadwyn ddeuol a ffurfiwyd gan ymhelaethiad PCR o'r templed Gadael DNA, yn ei wneud yn gadwyn sengl fel y gellir ei gyfuno â'r adweithydd preimio i baratoi ar gyfer yr adwaith preimio nesaf.②Anelio (cyfansoddyn) y patrymlun DNA a'r paent preimio: Ar ôl i'r DNA templed gael ei gynhesu a'i ddirywio'n un gadwyn, mae'r tymheredd yn disgyn i tua 55°C.Dilyniant cyflenwol y paent preimio a'r templed DNA cadwyn sengl.③ Estyniad y paent preimio: templed DNA - mae'r rhwymiad preimio yn seiliedig ar weithred TaqDNA polymeras, gyda dNTP fel deunydd crai yr adwaith.Cadwch yr egwyddor o ddyblygu, syntheseiddio cadwyn copi lled-gadw newydd sy'n cyd-fynd â'r gadwyn DNA templed, a gall proses ailadrodd dirywiad dirywiad-anelio-ymestyn tair proses gael mwy o "gadwyn copi lled-gadw", ac mae'r gadwyn newydd hon ar gael eto Dod yn dempled ar gyfer y cylch nesaf.Mae'n cymryd 2-4 munud i gwblhau'r ddolen, gall y genyn targed gael ei chwyddo sawl miliwn o weithiau mewn 2-3 awr.

SafonolPCRSystem Adwaith

Pum elfen o adwaith PCR

Mae pum math o sylweddau yn bennaf yn ymwneud ag adwaith PCR, sef paent preimio, ensym, dNTP, templed a byffer (mae angen Mg2+).[Gweithdrefn PCR]

Rhennir y broses PCR safonol yn dri cham

1. Dirywiad DNA (90°C-96°C): Templedi DNA cadwyn ddeuol o dan weithred thermol, bondiau hydrogen yn torri, gan ffurfio DNA cadwyn sengl.

2. Anelio (25 ℃ -65 ℃): Mae tymheredd y system yn cael ei ostwng, mae'r paent preimio yn cael ei gyfuno â'r templed DNA i ffurfio cadwyn ddeuol leol.

3. Estyniad (70 ℃ -75 ℃): O dan weithred ensym Taq (tua 72 ° C, y gweithgaredd gorau), defnyddir dNTP fel y deunydd crai, ymestyn o ddiwedd 5′ y primer → 3′ diwedd, mae synthesis a thempled yn ategu ei gilydd cadwyn DNA.

Mae pob cylch yn cael ei ddadnatureiddio, ei anelio a'i ymestyn, gan ddyblu'r cynnwys DNA.Ar hyn o bryd, oherwydd yr ardal ymhelaethu byr, gellir ailadrodd rhywfaint o PCR mewn amser byr iawn hyd yn oed os nad yw'r gweithgaredd ensym Taq yn optimaidd, felly gellir ei newid i ddau gam, hynny yw, gellir perfformio'r anelio a'r estyniad ar 60 ° C-65 ° C ar yr un pryd.Er mwyn lleihau'r broses o godi ac oeri a gwella'r cyflymder ymateb.

Nodweddion Adwaith PCR

● Uchel-Benodoledd

Ffactorau pendant penodol yr ymateb PCR yw: ①Y cyfuniad penodol o'r paent preimio a'r templed DNA.② Yr egwyddor o baru sylfaen.③Teyrngarwch adwaith synthesis polymeras TaqDNA.④ Penodoldeb a cheidwadolrwydd y genyn targed.

Y cyfuniad cywir o preimio a thempledi yw'r allwedd.Mae rhwymiad y primer a'r templed ac estyniad y gadwyn primer yn seiliedig ar yr egwyddor o baru sylfaen alcalïaidd.Gellir perfformio teyrngarwch adweithiau synthesis polymeras a gwrthiant tymheredd uchel y polymeras DNA Taq i wneud rhwymiad (cyfansoddyn) y templed a'r primer yn yr adwaith ar dymheredd uwch.Mae penodoldeb y cyfuniad yn cynyddu'n fawr.Gall y clip gynnal lefel uchel o gywirdeb.Trwy ddewis rhanbarth genetig targed gyda cheidwadaeth uchel a cheidwadolrwydd uchel, mae ei benodolrwydd yn uwch.

● Sensitifrwydd Uchel

Cynyddir cyfaint cynhyrchu cynhyrchion PCR yn ôl mynegai, a all ehangu templed cychwyn Picker (PG = 10-12) i gynyddu lefel y microreolydd i lefel y microgramau (μg = -6).Gellir canfod celloedd targed o 1 miliwn o gelloedd;wrth ganfod firysau, gall sensitifrwydd PCR gyrraedd 3 RFU (unedau ffurfio mannau gwag);y gyfradd ganfod isaf mewn gwyddoniaeth bacteriol yw 3 bacteria.

● Syml a Chyflym

Mae'r adlewyrchiad PCR yn defnyddio polymeras DNA Taq tymheredd uchel, sy'n ychwanegu'r ateb adwaith ar un adeg, hynny yw, adwaith dirywiad-anneal-estyniad ar yr hydoddiant ymhelaethu DNA a phot baddon dŵr.Yn gyffredinol, cwblheir yr adwaith ymhelaethu mewn 2 i 4 awr.Yn gyffredinol, caiff cynhyrchion estynedig eu dadansoddi gan gleddyf trydanol, ac nid oes rhaid iddynt ddefnyddio isotopau, dim llygredd ymbelydrol, a hyrwyddo hawdd.

● Mae purdeb y sbesimen yn isel

Nid oes angen gwahanu firysau na bacteria a chelloedd meithrin.Gellir defnyddio cynhyrchion crai DNA ac RNA fel mwyhaduron.Gellir defnyddio canfod ymhelaethiad DNA yn uniongyrchol gan ddefnyddio sbesimenau clinigol fel gwaed, hylif corff, hylif golchi peswch, gwallt, celloedd, a meinwe byw.

PCRproblemau cyffredin

● Negyddol ffug, dim bandiau chwyddedig

Mae camau allweddol yr adwaith PCR yn cynnwys: ① paratoi templed asidau niwclëig, ② ansawdd a phenodoldeb preimwyr, ③ ansawdd yr ensymau ④ amodau cylchred PCR.Dylid hefyd dadansoddi ac astudio dod o hyd i'r rheswm ar gyfer y dolenni uchod.

Templedi: ① Mae'r templed yn cynnwys protein amrywiol, ② Mae'r templed yn cynnwys atalydd ensymau Taq, ③ Nid yw'r protein yn y templed yn cael ei ddileu, yn enwedig y protein grŵp yn y cromosom.⑤ Nid yw dirywiad asid niwclëig Deminer yn drylwyr.Pan fydd ansawdd yr ensymau a'r paent preimio yn dda, nid oes band ymhelaethu, sef triniaeth dreulio sbesimenau yn fwyaf tebygol.Mae rhywbeth o'i le ar y templed proses echdynnu asid niwclëig, felly er mwyn paratoi datrysiad treulio effeithiol a sefydlog, dylai ei weithdrefn fod yn sefydlog ac ni ddylid ei newid yn fympwyol.

Anactifadu ensymau: dylid defnyddio ensym newydd neu ensymau hen a newydd gyda'i gilydd i ddadansoddi a yw actifedd yr ensym ar goll neu'n annigonol, gan arwain at negatifau ffug.Dylid nodi bod ensym Taq neu bromid ethidium yn cael ei anghofio weithiau.

Preimio: ansawdd y paent preimio, crynodiad y paent preimio, ac a yw crynodiad y ddau primer yn gymesur.Mae'n rheswm cyffredin dros fethiant PCR neu nid yw'r band cynyddol yn ddelfrydol ac yn dueddol o wasgaru.Ceir problemau gydag ansawdd paent preimio rhai swp-rifau.Mae gan y ddau primer grynodiad uchel a chrynodiad isel, gan achosi ymhelaethiad anghymesur effeithlonrwydd isel.Y gwrthfesurau yw: ① Dewiswch breimiwr da i syntheseiddio unedau.② Mae crynodiad y primer nid yn unig yn dibynnu ar y gwerth OD, ond hefyd yn rhoi sylw i hylif gwreiddiol y paent preimio i wneud electrofforesis gel siwgr agar.Rhaid cael parth stribed preimio, a dylai disgleirdeb y ddau primer fod yn gyson yn gyffredinol.Gall gwregys, PCR fethu ar hyn o bryd, a dylid ei ddatrys gyda'r uned synthesis primer.Os yw primer yn uchel, mae'r disgleirdeb yn isel, a rhaid cydbwyso ei grynodiad wrth ei wanhau.③ Dylid talu'r paent preimio a'i storio ar grynodiad uchel i atal rhewi lluosog neu rannau rheweiddio hirdymor o'r oergell, a fydd yn achosi i'r paent preimio ddirywio a diraddio.④ Mae dyluniad y paent preimio yn afresymol, fel hyd y paent preimio yn annigonol, ac mae'r clwstwr di yn cael ei ffurfio rhwng y paent preimio.

Mg2 + crynodiad: Mae crynodiad ïon Mg2 + yn cael effaith fawr ar effeithlonrwydd mwyhau PCR.Gall canolbwyntio gormodol leihau'r rhyw arall o ymhelaethiad PCR.Os yw'r crynodiad yn rhy isel, bydd yr allbwn ymhelaethu PCR hyd yn oed yn gwneud y methiant ymhelaethu PCR heb y band ehangu.

Newid cyfaint adwaith: Y gyfaint a ddefnyddir mewn ymhelaethu PCR yw 20ul, 30ul, a 50ul neu 100uL, mae cyfaint mawr y cais am ymhelaethu PCR wedi'i osod yn unol â gwahanol ddibenion ymchwil wyddonol a phrofion clinigol.Ar ôl gwneud cyfeintiau bach fel 20ul, mae angen gwneud cyflwr llinyn wrth wneud y maint, fel arall bydd yn methu.

Rhesymau ffisegol: Mae trawsnewid yn bwysig iawn ar gyfer ymhelaethu ar PCR.Os yw'r tymheredd dirywiad yn isel, mae'r amser dirywiad yn fyr, mae'n debygol o ddigwydd mewn negatifau ffug;gall tymheredd anelio rhy isel achosi mwyhad nad yw'n benodol a lleihau effeithlonrwydd ymhelaethu penodol.Effeithio'n fawr ar y cyfuniad o baent preimio a thempledi i leihau effeithlonrwydd mwyhau PCR.Weithiau mae angen defnyddio thermomedrau safonol i ganfod yr amrywioldeb, anelio a thymheredd estynedig yn yr estyniad neu'r popty sy'n hydoddi mewn dŵr, sef un o'r rhesymau dros fethiant y PCR.

Amrywiadau dilyniant targed: Os bydd y dilyniant targed yn digwydd, treiglad neu ddileu, mae cyfuniad y prototeip a'r templed yn cael eu cyfuno, neu oherwydd diffyg dilyniant targed, bydd y primer a'r templed yn colli'r dilyniant cyflenwol, ac ni fydd ei ymhelaethiad PCR yn llwyddiannus.

● Cadarnhaol ffug

Mae'r band ymhelaethu PCR yn ymddangos yn gyson â'r band dilyniant targed, ac weithiau mae ei fand yn fwy taclus ac yn uwch.

Nid yw dyluniad primer yn briodol: mae gan y dilyniant ymhelaethu a ddewiswyd a'r dilyniant ymhelaethu di-bwrpas homologaidd, felly pan fydd ymhelaethiad PCR, mae'r cynhyrchion PCR chwyddedig yn ddilyniannau nad ydynt yn bwrpasol.Mae'r dilyniant targed yn rhy fyr neu mae'r paent preimio yn rhy fyr, ac mae'n dueddol o gael positif ffug.Mae angen ei ailgynllunio.

Traws-lygredd dilyniant targed neu gynhyrchion ymhelaethu: Mae dau reswm dros y llygredd hwn: Yn gyntaf, croes-lygredd y genom cyfan neu segmentau mawr, gan arwain at bethau positif ffug.Gellir datrys y math hwn o bositif ffug trwy'r dulliau canlynol: Byddwch yn ofalus ac yn ysgafn yn ystod y llawdriniaeth i atal y dilyniant targed rhag cael ei fewnanadlu i'r gwn sampl neu dasgu allan o'r tiwb allgyrchol.Ac eithrio ensymau a sylweddau na allant wrthsefyll tymheredd uchel, dylid diheintio pob adweithydd neu offer â phwysedd uchel.Dylid defnyddio'r pibellau allgyrchol a'r samplau ar un adeg.Pan fo angen, cyn ychwanegu sbesimenau, mae'r tiwb adwaith a'r adweithydd yn agored i belydrau uwchfioled i ddinistrio'r asid niwclëig presennol.Yn ail, darnau bach yn y llygredd aer.Mae'r darnau bach hyn yn fyrrach na'r dilyniant targed, ond mae ganddyn nhw homoleg benodol.Gellir ei rannu â'i gilydd.Ar ôl ategu'r paent preimio, gellir ehangu'r cynnyrch PCR, a fydd yn achosi cynhyrchu positif ffug.Gellir ei ddefnyddio i leihau neu ddileu'r dull PCR nyth.

● Ymddangos band ymhelaethu nonspecific

Mae'r bandiau a ymddangosodd ar ôl ymhelaethu PCR yn anghyson â'r maint disgwyliedig, neu fawr neu fach, neu ar yr un pryd, neu ar yr un pryd, bandiau ymhelaethu penodol a bandiau ymhelaethu amhenodol.Ymddangosiad bandiau amhenodol yw: Yn gyntaf, mae'r paent preimio yn anghyflawn sy'n ategu'r dilyniant targed, neu bolymeru'r paent preimio i ffurfio clwstwr di.Yr ail yw bod crynodiad ïonau MG2 + yn rhy uchel, mae'r tymheredd anelio yn rhy isel, ac mae nifer y cylchoedd PCR yn gysylltiedig.Yn ail, ansawdd a swm yr ensymau.Yn aml, mae ensymau rhai ffynonellau yn dueddol o gael bandiau nad ydynt yn arbennig ac nid yw ensymau'r ffynhonnell arall yn digwydd.Weithiau bydd ymhelaethiad amhenodol ar ensymau hefyd yn digwydd.Y gwrth-fesurau yw: ail-ddylunio atyniadau os oes angen.Lleihau faint o ensym neu ddisodli'r ensym o ffynhonnell arall.Lleihau faint o gynradd, cynyddu nifer y templedi yn briodol, a lleihau nifer y cylchoedd.Cynyddwch y tymheredd anelio yn iawn neu defnyddiwch y dull dau bwynt tymheredd (dirywiad 93 ° C, anelio ac ymestyn tua 65 ° C).

● Ymddangoswch fel tynnu fflawiog neu dâp ceg y groth

Weithiau mae'n ymddangos bod ymhelaethiad PCR yn cael ei gymhwyso neu ei gragen neu wregys tebyg i garped.Am y rheswm, oherwydd y swm gormodol o ensymau neu ansawdd gwael yr ensym, mae'r crynodiad dNTP yn rhy uchel, mae'r crynodiad Mg2 + yn rhy uchel, mae'r tymheredd anelio yn rhy isel, ac mae nifer y cylchoedd yn ormod.Y gwrthfesurau yw: ① Lleihau faint o ensymau, neu newid ensym ffynhonnell arall.② Lleihau crynodiad dNTP ③ Lleihau crynodiad Mg2+ yn briodol.④ Cynyddu nifer y templedi a lleihau nifer y cylchoedd.

Cynhyrchion Cysylltiedig

PCR Heroᵀᴹ (Gyda Dye)

◮ Ffyddlondeb uwch: 6 gwaith yn fwy nag ensym Taq cyffredin;

◮ Cyflymder mwyhau cyflymach

◮ Mwy o hyblygrwydd templed

◮ Effeithlonrwydd mwyhau uwch

◮ Mae goddefgarwch amgylcheddol yn gryfach: wedi'i osod ar 37 ° C am wythnos, gan gynnal mwy na 90% o weithgaredd;

◮ Mae ganddo actifedd DNA polymeras 5'→3' a gweithgaredd ec-niwcleas 5'→3', heb actifedd ec-niwcleas 3'→5'.

PCR Easy (Gyda Dye)

Mae'r system adwaith unigryw a Taq DNA Polymerase effeithlonrwydd uchel yn golygu bod gan yr adwaith PCR effeithlonrwydd ymhelaethu, penodoldeb a sensitifrwydd uwch.

RT-qPCR Easy (Un Cam) -SYBR Gwyrdd I

◮ Mae pecyn un cam yn gwneud trawsgrifio gwrthdro a qPCR dau adwaith yn yr un tiwb, dim ond angen ychwanegu RNA templed, paent preimio PCR penodol a ddH heb RNase₂O.

◮ Gall y pecyn ddadansoddi RNA firaol neu olrhain RNA yn feintiol yn gyflym ac yn effeithlon.

◮ Mae'r pecyn yn defnyddio adweithydd trawsgrifio gwrthdro Foregene unigryw a Polymerase DNA Foregene HotStar Taq ynghyd â system adwaith unigryw i wella effeithlonrwydd mwyhau a phenodoldeb yr adwaith yn effeithiol.

◮ Mae'r system adwaith optimaidd yn golygu bod gan yr adwaith sensitifrwydd canfod uwch, sefydlogrwydd thermol cryfach, a goddefgarwch gwell.

◮ RT-qPCR Hawdd^TM(Un Cam) -Mae pecyn Gwyrdd I SYBR yn dod â llifyn cyfeirio mewnol ROX, y gellir ei ddefnyddio i ddileu cefndir signal a gwallau signal rhwng ffynhonnau, sy'n gyfleus i gwsmeriaid eu defnyddio mewn gwahanol fodelau o offerynnau PCR meintiol.

RT Hawdd^TMII (Master Premix ar gyfer synthesis cDNA llinyn cyntaf ar gyferPCR amser real)

-Gallu effeithlon i gael gwared ar gDNA, a all gael gwared ar gDNA yn y templed o fewn 2 funud.

-System trawsgrifio gwrthdro effeithlon, dim ond 15 munud y mae'n ei gymryd i gwblhau synthesis cDNA llinyn cyntaf.

-Templedi cymhleth: gellir gwrthdroi templedi gyda chynnwys GC uchel a strwythur eilaidd cymhleth hefyd gydag effeithlonrwydd uchel.

-System trawsgrifio gwrthdro sensitifrwydd uchel, gall templedi lefel td hefyd gael cDNA o ansawdd uchel.

-Mae gan y system trawsgrifio gwrthdro sefydlogrwydd thermol uchel, y tymheredd adwaith gorau posibl yw 42 ℃, ac mae ganddi berfformiad trawsgrifio cefn da o hyd ar 50 ℃.