Mae PCR (adwaith cadwyn polymeras) yn un o'r technolegau mwyhau DNA in-vitro, sydd â hanes o fwy na 30 mlynedd.

Arloeswyd technoleg PCR gan Kary Mullis o Cetus, UDA ym 1983. Ymgeisiodd Mullis am batent PCR ym 1985 a chyhoeddodd y papur academaidd PCR cyntaf ar Wyddoniaeth yn yr un flwyddyn.Enillodd Mullis Wobr Nobel mewn Cemeg ym 1993 am ei waith.

Egwyddorion Sylfaenol PCR

Gall PCR chwyddo darnau DNA targed fwy na miliwn o weithiau.Mae'r egwyddor o dan gatalysis DNA polymeras, gan ddefnyddio DNA llinyn rhiant fel templed a phremiwr penodol fel man cychwyn ar gyfer estyniad.Mae'n cael ei ailadrodd in vitro trwy gamau fel dadnatureiddio, anelio ac ymestyn.Y broses o DNA llinyn merch yn ategu'r templed DNA llinyn rhiant.

Rhennir y broses PCR safonol yn dri cham:

1.Denaturation: Defnyddiwch dymheredd uchel i wahanu llinynnau dwbl DNA.Mae'r bond hydrogen rhwng llinynnau dwbl DNA yn cael ei dorri ar dymheredd uchel (93-98 ℃).

2.Annealing: Ar ôl i'r DNA llinyn dwbl gael ei wahanu, gostyngwch y tymheredd fel y gall y paent preimio rhwymo i'r DNA un edefyn.

3.Estyniad: Mae'r DNA polymeras yn dechrau syntheseiddio llinynnau cyflenwol ar hyd y llinynnau DNA o'r preimwyr sydd wedi'u rhwymo pan fydd y tymheredd yn cael ei ostwng.Pan gwblheir yr estyniad, cwblheir cylchred, ac mae nifer y darnau DNA yn dyblu

Gan ail-wneud y tri cham hyn 25-35 gwaith, bydd nifer y darnau DNA yn cynyddu'n esbonyddol.

Dyfeisgarwch PCR yw y gellir dylunio paent preimio gwahanol ar gyfer gwahanol enynnau targed, fel y gellir chwyddo darnau genynnau targed mewn cyfnod byr o amser.

Hyd yn hyn, gellir rhannu PCR yn dri chategori, sef PCR cyffredin, PCR meintiol fflwroleuol a PCR digidol.

Y genhedlaeth gyntaf o PCR cyffredin

Defnyddiwch offeryn ymhelaethu PCR cyffredin i ymhelaethu ar y genyn targed, ac yna defnyddiwch electrofforesis gel agarose i ganfod y cynnyrch, dim ond dadansoddiad ansoddol y gellir ei wneud.

Prif anfanteision PCR cenhedlaeth gyntaf:

1.Prone i ymhelaethu amhenodol a chanlyniadau positif ffug.

2.Mae'r canfod yn cymryd amser hir ac mae'r llawdriniaeth yn feichus.

Gellir gwneud prawf ansoddol 3.Only

PCR Amser Real yr ail genhedlaeth

Mae PCR Amser Real, a elwir hefyd yn qPCR, yn defnyddio stilwyr fflwroleuol a all nodi cynnydd y system adwaith, ac yn monitro casgliad cynhyrchion chwyddedig trwy gronni signalau fflwroleuol, ac yn barnu'r canlyniadau trwy'r gromlin fflworoleuedd.Gellir ei fesur gyda chymorth gwerth Cq a chromlin safonol.

Oherwydd bod y dechnoleg qPCR yn cael ei chynnal mewn system gaeedig, mae'r tebygolrwydd o halogiad yn cael ei leihau, a gellir monitro'r signal fflworoleuedd ar gyfer canfod meintiol, felly dyma'r un a ddefnyddir fwyaf mewn ymarfer clinigol ac mae wedi dod yn dechnoleg amlycaf yn PCR.

Gellir rhannu'r sylweddau fflwroleuol a ddefnyddir mewn PCR meintiol fflwroleuol amser real yn: stiliwr fflwroleuol TaqMan, goleuadau moleciwlaidd a llifyn fflwroleuol.

1) stiliwr fflworoleuol TaqMan:

Yn ystod ymhelaethiad PCR, ychwanegir stiliwr fflwroleuol penodol wrth ychwanegu pâr o preimio.Mae'r stiliwr yn oligonucleotid, ac mae'r ddau ben wedi'u labelu â grŵp fflworoleuol gohebydd a grŵp fflworoleuol quencher.

Pan fydd y stiliwr yn gyfan, mae'r signal fflwroleuol a allyrrir gan y grŵp adrodd yn cael ei amsugno gan y grŵp diffodd;yn ystod ymhelaethu PCR, mae gweithgaredd exonuclease 5′-3′ o ensym Taq yn hollti ac yn diraddio'r chwiliwr, gan wneud y grŵp fflwroleuol gohebydd a quencher Mae'r grŵp fflwroleuol yn cael ei wahanu, fel bod y system monitro fflworoleuedd yn gallu derbyn y signal fflworoleuedd, hynny yw, bob tro mae llinyn DNA yn cael ei chwyddo, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n llwyr, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n llwyr, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n llwyr, mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n gyfan gwbl, ac mae'r signal fflworoleuol yn cael ei chwyddo'n gyfan gwbl. gyda ffurfio'r cynnyrch PCR.

2) Lliw fflwroleuol SYBR:

Yn y system adwaith PCR, ychwanegir gormodedd o liw fflwroleuol SYBR.Ar ôl i'r llifyn fflwroleuol SYBR gael ei ymgorffori'n amhenodol yn y llinyn dwbl DNA, mae'n allyrru signal fflwroleuol.Ni fydd y moleciwl lliw SYBR nad yw wedi'i ymgorffori yn y gadwyn yn allyrru unrhyw signal fflwroleuol, a thrwy hynny sicrhau'r signal fflwroleuol Mae'r cynnydd mewn cynhyrchion PCR wedi'i gydamseru'n llwyr â'r cynnydd mewn cynhyrchion PCR.Mae SYBR yn rhwymo i DNA dwbl yn unig, felly gellir defnyddio'r gromlin doddi i benderfynu a yw'r adwaith PCR yn benodol.

3) Beacon moleciwlaidd:

Mae'n stiliwr oligonucleotid label-dwbl dolen goes sy'n ffurfio strwythur pin gwallt o tua 8 gwaelod yn y 5 a 3 pen.Mae'r dilyniannau asid niwclëig ar y ddau ben yn cael eu paru'n gyflenwol, gan achosi i'r grŵp fflwroleuol a'r grŵp diffodd fod yn dynn.Yn agos, ni chynhyrchir fflworoleuedd.

Ar ôl i'r cynnyrch PCR gael ei gynhyrchu, yn ystod y broses anelio, mae rhan ganol y beacon moleciwlaidd yn cael ei baru â dilyniant DNA penodol, ac mae'r genyn fflwroleuol yn cael ei wahanu oddi wrth y genyn quencher i gynhyrchu fflworoleuedd.

Prif anfanteision PCR ail genhedlaeth:

Mae sensitifrwydd yn dal i fod yn ddiffygiol, ac mae canfod sbesimenau copi isel yn anghywir.

Mae dylanwad y gwerth cefndirol, ac mae'r canlyniad yn agored i ymyrraeth.

Pan fo atalyddion PCR yn y system adwaith, mae'r canlyniadau canfod yn agored i ymyrraeth.

PCR digidol trydedd genhedlaeth

Mae PCR Digidol (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) yn cyfrifo rhif copi y dilyniant targed trwy ganfod diweddbwynt, a gall berfformio canfod meintiol absoliwt cywir heb ddefnyddio rheolaethau mewnol a chromliniau safonol.

Mae PCR digidol yn defnyddio canfod diweddbwynt ac nid yw'n dibynnu ar y gwerth Ct (trothwy beicio), felly mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn effeithio'n llai ar yr adwaith PCR digidol, ac mae'r goddefgarwch i atalyddion adwaith PCR yn cael ei wella, gyda chywirdeb uchel ac atgynhyrchedd.

Oherwydd nodweddion sensitifrwydd uchel a chywirdeb uchel, nid yw atalyddion adwaith PCR yn ymyrryd yn hawdd, a gall gyflawni meintioliad gwirioneddol absoliwt heb gynhyrchion safonol, sydd wedi dod yn fan cychwyn ymchwil a chymhwyso.

Yn ôl gwahanol ffurfiau'r uned adwaith, gellir ei rannu'n dri phrif fath: systemau microfluidig, sglodion a defnynnau.

1) PCR digidol microfluidig, mdPCR:

Yn seiliedig ar y dechnoleg microhylifol, mae'r templed DNA wedi'i wahanu.Gall y dechnoleg microfluidig ​​wireddu'r uwchraddio nano-sampl neu gynhyrchu defnynnau llai, ond mae angen dull arsugniad arbennig ar y defnynnau ac yna eu cyfuno â'r system adwaith PCR.mdPCR wedi'i fabwysiadu'n raddol gan ddulliau eraill yn lle.

2) PCR digidol yn seiliedig ar ddefnyn, ddPCR:

Defnyddiwch dechnoleg cynhyrchu defnynnau dŵr-mewn-olew i brosesu'r sampl yn ddefnynnau, a rhannwch y system adwaith sy'n cynnwys moleciwlau asid niwclëig yn filoedd o ddefnynnau nanoraddfa, ac nid yw pob un ohonynt yn cynnwys y moleciwl targed asid niwclëig i'w ganfod, neu Yn cynnwys un i sawl moleciwl targed asid niwclëig i'w brofi.

3) PCR digidol yn seiliedig ar sglodion, cdPCR:

Defnyddiwch y dechnoleg llwybr hylif integredig i ysgythru llawer o ficro-tiwbiau a microcavities ar wafferi silicon neu wydr cwarts, a rheoli llif yr ateb trwy wahanol falfiau rheoli, a rhannwch yr hylif sampl yn nanometrau o'r un maint i'r ffynhonnau adwaith ar gyfer Adwaith PCR digidol i gyflawni meintioliad absoliwt.

Prif anfanteision y trydydd cenhedlaeth PCR:

Mae'r offer a'r adweithyddion yn ddrud.

Mae gofynion ansawdd y templed yn uchel.Os yw maint y templed yn fwy na maint y microsystem, bydd yn amhosibl ei feintioli, ac os yw'n rhy fach, bydd y cywirdeb meintiol yn cael ei leihau.

Gall positifau ffug hefyd gael eu cynhyrchu pan fo ymhelaethu amhenodol.