Mae COVID-19 yn glefyd heintus a achosir gan Syndrom Anadlol Acíwt Difrifol Coronafeirws Math 2. Pan fydd person wedi'i heintio, mae'r symptomau mwyaf cyffredin yn cynnwys twymyn, peswch, a diffyg anadl.

Gall y samplau a ddefnyddir ar gyfer profi gael eu casglu gan swabiau nasopharyngeal neu swabiau oroffaryngeal.

Beth yw PCR?

Y dull safonol o ganfod coronafirws yw adwaith cadwyn polymeras, PCR.Mae hwn yn ddull a ddefnyddir yn helaeth mewn bioleg foleciwlaidd.Gall gopïo miliynau i biliynau o ddarnau DNA penodol yn gyflym.

Mae'r coronafirws newydd yn cynnwys genom RNA un llinyn hir iawn.Er mwyn canfod y firysau hyn trwy PCR, rhaid trosi moleciwlau RNA yn eu dilyniannau DNA cyflenwol trwy drawsgrifiad gwrthdro, ac yna gellir chwyddo'r DNA sydd newydd ei syntheseiddio gan weithdrefnau PCR safonol, a elwir yn gyffredin yn RT-PCR.

Proses RT-PCR

echdynnu RNA

Er mwyn cyflawni'r dull hwn, dylid echdynnu RNA firaol yn y bôn.Gellir defnyddio amrywiaeth o becynnau puro RNA ar gyfer gwahanu cyfleus, cyflym ac effeithiol.

I echdynnu RNA firaol gan ddefnyddio pecyn masnachol, ychwanegwch y sampl yn gyntaf at diwb microcentrifuge ac yna ei gymysgu â'r byffer lysis.Mae'r byffer hwn wedi'i ddadnatureiddio'n fawr ac fel arfer mae'n cynnwys isothiocyanate ffenol a guanidine.Yn ogystal, mae atalyddion RNase fel arfer yn bresennol yn y byffer lysis i sicrhau ynysu RNA firaol cyfan.

Ar ôl ychwanegu'r byffer lysis, vortex y tiwb cymysgu gan curiad y galon a deor ar dymheredd ystafell.Yna mae'r firws yn cael ei lysed o dan amodau dadnatureiddiol iawn a ddarperir gan y byffer lysis.

Ar ôl i'r sampl gael ei lysed, defnyddir tiwb centrifuge ar gyfer y weithdrefn buro.Mae'r sampl yn cael ei lwytho i mewn i'r tiwb centrifuge ac yna'n cael ei allgyrchu.

Mae'r weithdrefn hon yn ddull echdynnu cyfnod solet lle mae'r cyfnod llonydd yn cynnwys matrics gel silica.

O dan amodau halen a pH gorau posibl, mae moleciwlau RNA yn rhwymo i'r bilen silica.

Ar yr un pryd, mae protein a halogion eraill yn cael eu tynnu.

Ar ôl centrifugation, rhowch y tiwb centrifuge i mewn i tiwb casglu glân, taflu'r hidlydd, ac yna ychwanegu byffer golchi.

Rhowch y tiwb yn y centrifuge eto i orfodi'r byffer golchi drwy'r bilen.Bydd hyn yn cael gwared ar yr holl amhureddau sy'n weddill o'r bilen, gan adael dim ond yr RNA wedi'i rwymo i'r gel silica.

Ar ôl i'r sampl gael ei olchi, rhowch y tiwb mewn tiwb microcentrifuge glân ac ychwanegwch y byffer elution.

Yna caiff ei allgyrchu i orfodi'r byffer elution drwy'r bilen.Mae'r byffer elution yn tynnu RNA firaol o'r golofn sbin ac yn cael RNA wedi'i buro yn rhydd o broteinau, atalyddion a halogion eraill.

CAM 2

Dwysfwyd cymysg

Ar ôl echdynnu'r RNA firaol, y cam nesaf yw paratoi'r cymysgedd adwaith ar gyfer ymhelaethu PCR.Yn y cam hwn, defnyddir dwysfwyd.Mae'r hydoddiant crynodedig hwn yn hydoddiant crynodedig wedi'i gymysgu'n barod sy'n cynnwys rhag-gymysgedd, trawsgrifiad gwrthdro, niwcleotidau, preimiwr blaen, preimiwr gwrthdro, stiliwr TaqMan a DNA polymeras.

Yn olaf, i gwblhau'r cymysgedd adwaith hwn, ychwanegir y templed RNA.Mae'r tiwbiau'n cael eu cymysgu gan vortexing pwls, ac yna mae'r cymysgedd adwaith yn cael ei lwytho i'r plât PCR.Mae'r plât PCR fel arfer yn cynnwys 96 o ffynhonnau a gall ddadansoddi samplau lluosog ar yr un pryd.

CAM 3

ymhelaethiad PCR

Nesaf, rhowch y plât yn y peiriant PCR, sydd yn ei hanfod yn gylchredwr thermol.

Defnyddir RT-PCR amser real i ganfod coronafirws newydd 2019 trwy ymhelaethu ar y dilyniant targed yn y genyn RdrRP, genyn E a genyn N.Mae'r dewis o genyn targed yn dibynnu ar y dilyniant preimio a stiliwr.

Cam cyntaf RT-PCR yw trawsgrifio gwrthdro.Mae llinyn cyntaf DNA cyflenwol yn cael ei syntheseiddio, sy'n cael ei gychwyn gan y paent preimio gwrthdro PCR, sy'n clymu i ran gyflenwol y genom RNA firaol.Yna mae transcriptase gwrthdro yn ychwanegu niwcleotidau DNA i ben 3′y preimiwr i syntheseiddio DNA sy'n ategu'r RNA firaol.Mae tymheredd a hyd y cam hwn yn dibynnu ar y paent preimio, yr RNA targed, a'r trawsgrifiad gwrthdro a ddefnyddir.

Nesaf, mae cam dadnatureiddio cychwynnol yn cael ei gymhwyso, sy'n arwain at ddadnatureiddio'r hybrid RNA-DNA.Mae'r cam hwn yn angenrheidiol i actifadu'r DNA polymeras.Ar yr un pryd, mae transcriptase gwrthdro yn anactifadu.

Mae PCR yn cynnwys cyfres o gylchredau thermol.Mae pob cylch yn cynnwys camau dadnatureiddio, anelio ac ymestyn.

Mae'r cam dadnatureiddio yn cynnwys gwresogi'r siambr adwaith i 95 gradd Celsius a'i ddefnyddio i ddadnatureiddio'r templed DNA llinyn dwbl.

Yn y cam nesaf, mae tymheredd yr adwaith yn cael ei ostwng i 58 gradd Celsius, gan ganiatáu i'r preimiwr blaen anelio i ran gyflenwol ei dempled DNA un edefyn.Mae'r tymheredd anelio yn dibynnu'n uniongyrchol ar hyd a chyfansoddiad y paent preimio.

Yn y cam ymestyn, mae'r DNA polymeras yn syntheseiddio llinyn DNA newydd sy'n cyd-fynd â'r llinyn templed DNA.Trwy ychwanegu niwclysau rhydd sy'n ategu'r templed i'r cyfeiriad 5′ i 3′ o gymysgedd yr adwaith.Mae tymheredd y cam hwn yn dibynnu ar y DNA polymeras a ddefnyddir.

Ar ôl y cylch cyntaf, ceir targed DNA dwy haen.

Yna, rhowch yr ail gylchred.Mae'r DNA llinyn dwbl wedi'i ddadnatureiddio i gynhyrchu dau foleciwl DNA un edefyn.

Yn y cam nesaf, mae tymheredd yr adwaith yn cael ei ostwng, mae'r paent preimio'n cael ei anelio i bob templed DNA un edefyn, ac mae'r stiliwr Taq-man yn cael ei anelio i'r rhan gyflenwol o'r DNA targed.

Mae stiliwr TaqMan yn cynnwys fflworoffor sydd wedi'i gysylltu'n cofalent â phen 5′pen y stiliwr oligonucleotid.Pan gaiff ei gyffroi gan ffynhonnell golau y beiciwr, mae'r fflworoffor yn allyrru fflworoleuedd.Yn ogystal, mae'r stiliwr yn cynnwys quencher ar y pen 3′.Mae agosrwydd y genyn gohebydd at y quencher yn atal canfod fflworoleuedd.

Yn y cam ymestyn, mae'r DNA polymeras yn syntheseiddio llinyn newydd.Pan fydd y polymeras yn cyrraedd y stiliwr TaqMan, mae ei actifedd 5′niwcleas mewndarddol yn hollti'r stiliwr, gan wahanu'r llifyn oddi wrth y quencher.

Gyda phob cylch o PCR, mae mwy o foleciwlau llifyn yn cael eu rhyddhau, gan arwain at gynnydd mewn dwyster fflworoleuedd sy'n gymesur â nifer yr amplicons wedi'u syntheseiddio.

Mae'r dull hwn yn caniatáu amcangyfrif nifer y dilyniant penodol sy'n bresennol yn y sampl.Mae nifer y darnau DNA â llinyn dwbl yn dyblu ym mhob cylchred.Felly, gellir defnyddio PCR i ddadansoddi samplau bach iawn.

Ar gyfer mesur signal fflwroleuol, lamp halogen twngsten, hidlydd cyffroi, adlewyrchydd, lens, hidlydd allyriadau a chamera CCD sy'n defnyddio dyfais wefru.

CAM 4 Canfod

Ar gyfer mesur signal fflwroleuol, lamp halogen twngsten, hidlydd cyffroi, adlewyrchydd, lens, hidlydd allyriadau a chamera CCD sy'n defnyddio dyfais wefru.

Mae'r golau wedi'i hidlo o'r lamp yn cael ei adlewyrchu gan yr adlewyrchydd, yn mynd trwy'r lens cyddwysydd, ac yn canolbwyntio ar ganol pob twll.Yna mae'r fflworoleuedd a allyrrir o'r twll yn cael ei adlewyrchu o'r drych, yn mynd trwy'r hidlydd allyriadau, ac yn cael ei ganfod gan y camera CCD.Ym mhob cylch PCR, gall y CCD ganfod y golau fflworoffor hunan-gyffrous.

Mae'n trosi'r golau a ddaliwyd yn ddata digidol.Gelwir y dull hwn yn PCR amser real, ac mae'n caniatáu monitro amser real o gynnydd yr adwaith PCR.