Trosolwg
Adnabod planhigion trawsenynnol yn gyflym
Testun/Tong Yucheng
Gweithrediad arbrofol/Han Ying
Golygydd/Wen Youjun
Geiriau/1600+
Amser darllen a awgrymir/8-10 munud
Adnabod planhigion trawsenynnol yn gyflym
Fel newydd-ddyfodiad yn y labordy, nid yw'n waith da sgrinio planhigion positif allan o griw o blanhigion sydd â chyfradd trosi isel.Yn gyntaf, rhaid echdynnu DNA o nifer fawr o samplau fesul un, ac yna bydd y genynnau tramor yn cael eu canfod gan PCR.Fodd bynnag, mae'r canlyniadau yn aml yn fylchau ac yn fandiau gydag ychydig o eitemau o bryd i'w gilydd, ond mae'n amhosibl pennu a oes darganfyddiadau wedi'u methu neu ganfyddiadau ffug..Ydy hi'n ddiymadferth iawn wynebu proses a chanlyniadau arbrofol o'r fath?Peidiwch â phoeni, mae brawd yn eich dysgu sut i sgrinio planhigion positif trawsenynnol yn hawdd ac yn gywir.
Cam 1: Dyluniad paent preimio canfod
Darganfyddwch y genyn mewndarddol a'r genyn alldarddol i'w ganfod yn ôl y sampl i'w brofi, a dewiswch ddilyniant cynrychioliadol 100-500bp yn y genyn ar gyfer dylunio paent preimio.Gall preimwyr da sicrhau cywirdeb y canlyniadau canfod a byrhau'r amser canfod (gweler yr atodiad ar gyfer paent preimio canfod a ddefnyddir yn gyffredin).
Nodyn:
Mae angen i'r paent preimio sydd newydd ei ddylunio wneud y gorau o'r amodau adwaith a gwirio cywirdeb, manwl gywirdeb a therfyn canfod y darganfyddiad cyn perfformio canfod ar raddfa fawr.
Cam 2:Datblygu protocol arbrofol
Rheolaeth gadarnhaol: Defnyddiwch y DNA puredig sy'n cynnwys y darn targed fel templed i benderfynu a yw'r system adwaith PCR a'r amodau yn normal.
Rheolaeth negyddol/gwag: Defnyddiwch dempled DNA neu ddH2O nad yw'n cynnwys y darn targed fel templed i ganfod a oes ffynhonnell halogiad yn y system PCR.
Rheolaeth gyfeirio fewnol: defnyddiwch y cyfuniad paent preimio/chwiliwr o enyn mewndarddol y sampl i'w brofi i werthuso a all PCR ganfod y templed.
Nodyn:
Dylid gosod rheolaethau cadarnhaol, negyddol/gwag a rheolaethau rheolaeth fewnol ar gyfer pob prawf er mwyn gwerthuso dilysrwydd canlyniadau'r arbrawf.
Cam 3: Paratoi ar gyfer arbrawf
Cyn ei ddefnyddio, arsylwch a yw'r ateb wedi'i gymysgu'n gyfartal.Os canfyddir dyddodiad, mae angen ei doddi a'i gymysgu yn unol â'r cyfarwyddiadau cyn ei ddefnyddio.Mae angen pibedu cymysgedd 2 × PCR a'i gymysgu dro ar ôl tro gyda micropiped cyn ei ddefnyddio er mwyn osgoi dosbarthiad ïon anwastad.
Nodyn:
Tynnwch y cyfarwyddiadau allan a'u darllen yn ofalus, a gwnewch baratoadau cyn yr arbrawf yn gwbl unol â'r cyfarwyddiadau.
Cam 4: Paratoi system adwaith PCR
Yn ôl y protocol arbrofol, cymysgwch y paent preimio, H2O, cymysgedd 2 × PCR, centrifuge a'u dosbarthu i bob tiwb adwaith.
Nodyn:
Ar gyfer profion ar raddfa fawr neu hirdymor, argymhellir defnyddio system adwaith PCR sy'n cynnwys ensym UNG, a all osgoi halogiad aerosol a achosir gan gynhyrchion PCR yn effeithiol.
Cam 5: Ychwanegu templed adwaith
Gan ddefnyddio technoleg Direct PCR, nid oes angen proses puro asid niwclëig diflas.Gellir paratoi'r templed sampl o fewn 10 munud a'i ychwanegu at y system adwaith PCR cyfatebol.
Nodyn:
Mae gan ddull Lysis effaith ganfod well, a gellir defnyddio'r cynnyrch a gafwyd ar gyfer adweithiau canfod lluosog.
5.1: PCR uniongyrchol o ddail
Yn ôl maint y llun yn y llawlyfr, torrwch y meinwe dail gyda diamedr o 2-3mm a'i roi yn y system adwaith PCR.
Nodyn: Sicrhewch fod y darnau dail yn cael eu trochi'n llwyr yn yr ateb adwaith PCR, a pheidiwch ag ychwanegu meinwe dail gormodol.
5.2: Dull lysis dail
Torrwch feinwe'r ddeilen â diamedr o 5-7mm a'i roi mewn tiwb centrifuge.Os dewiswch ddail aeddfed, ceisiwch osgoi defnyddio meinweoedd prif wythïen y ddeilen.Pibed 50ul Clustog P1 lysate i mewn i tiwb centrifuge i sicrhau bod y lysate yn gallu trochi meinwe'r dail yn llwyr, ei roi mewn cylchredwr thermol neu baddon metel, a lyse ar 95 ° C am 5-10 munud.
Ychwanegu datrysiad niwtraliad Clustog 50ul P2 a chymysgu'n dda.Gellir defnyddio'r lysate canlyniadol fel templed a'i ychwanegu at y system adwaith PCR.
Sylwer: Dylai swm y templed fod rhwng 5-10% o'r system PCR, ac ni ddylai fod yn fwy na 20% (er enghraifft, mewn system PCR 20μl, ychwanegwch 1-2μl o glustogiad lysis, dim mwy na 4μl).
Cam 6: Ymateb PCR
Ar ôl centrifugio'r tiwb adwaith PCR, rhowch nhw mewn offeryn PCR i'w mwyhau.
Nodyn:
Mae'r adwaith yn defnyddio templed heb ei buro ar gyfer ymhelaethu, felly mae nifer y cylchoedd mwyhau 5-10 yn fwy o gylchoedd nag wrth ddefnyddio templed DNA wedi'i buro.
Cam 7: Canfod electrofforesis a dadansoddi canlyniadau
M:100bp Ysgol DNA
1\4: Dull DNA wedi'i buro
2 \ 5: Dull PCR uniongyrchol
3\6: Rheolaeth wag
Rheoli Ansawdd:
Dylai canlyniadau prawf y rheolaethau amrywiol a osodwyd yn yr arbrawf fodloni'r amodau canlynol.Fel arall, dylid dadansoddi achos y broblem, a dylid cynnal y prawf eto ar ôl i'r broblem gael ei dileu.
Tabl 1. Canlyniadau profion arferol gwahanol grwpiau rheoli
*Pan ddefnyddir y plasmid fel rheolydd positif, gall canlyniad y prawf genyn mewndarddol fod yn negyddol
Dyfarniad canlyniad:
A. Mae canlyniad prawf genyn mewndarddol y sampl yn negyddol, sy'n nodi na ellir tynnu'r DNA sy'n addas ar gyfer canfod PCR cyffredin o'r sampl neu mae'r DNA a echdynnwyd yn cynnwys atalyddion adwaith PCR, a dylid echdynnu'r DNA eto.
B. Mae canlyniad prawf genyn mewndarddol y sampl yn bositif, ac mae canlyniad prawf y genyn alldarddol yn negyddol, sy'n dangos bod y DNA sy'n addas ar gyfer canfod PCR cyffredin yn cael ei dynnu o'r sampl, a gellir barnu nad yw'r genyn XXX yn cael ei ganfod yn y sampl.
C. Mae canlyniad prawf genyn mewndarddol y sampl yn bositif, ac mae canlyniad prawf y genyn alldarddol yn bositif, gan nodi bod y DNA sy'n addas ar gyfer canfod PCR cyffredin wedi'i dynnu o'r sampl, ac mae'r sampl DNA yn cynnwys y genyn XXX.Gellir cynnal arbrofion cadarnhau ymhellach.
Cam 8: Dylunio paent preimio canfod
Ar ôl yr arbrawf, defnyddiwch hydoddiant hypoclorit sodiwm 2% a hydoddiant ethanol 70% i sychu'r ardal arbrofol i atal llygredd amgylcheddol.
Atodiad
Tabl 2. Preimwyr a ddefnyddir yn gyffredin ar gyfer canfod PCR cyffredinol o blanhigion a addaswyd yn enetig
Dogfen gyfeirio:
SN/T 1202-2010, Dull canfod PCR ansoddol ar gyfer cynhwysion planhigion a addaswyd yn enetig mewn bwyd.
Cyhoeddiad y Weinyddiaeth Amaeth 1485-5-2010, Profi cynhwysion planhigion a addaswyd yn enetig a'u cynhyrchion - reis M12 a'i ddeilliadau.
Amser postio: Mehefin-09-2021
