一, Cynyddu sensitifrwydd y system adwaith:

1. ynysu RNA o ansawdd uchel:

Daw synthesis cDNA llwyddiannus o RNA o ansawdd uchel.Dylai RNA o ansawdd uchel o leiaf fod yn hyd llawn ac yn rhydd o atalyddion trawsgrifiad gwrthdro fel EDTA neu SDS.Mae ansawdd RNA yn pennu uchafswm y wybodaeth ddilyniant y gallwch ei thrawsgrifio i cDNA.Mae dull puro RNA cyffredin yn ddull un cam gan ddefnyddio isothiocyanate guanidine / ffenol asid.Er mwyn atal halogiad gan symiau hybrin o RNase, mae angen storio RNA sydd wedi'i ynysu o samplau cyfoethog RNase (fel pancreas) mewn fformaldehyd i gadw RNA o ansawdd uchel, yn enwedig ar gyfer storio hirdymor.Cafodd yr RNA a dynnwyd o afu llygod mawr ei ddiraddio yn y bôn ar ôl cael ei storio mewn dŵr am wythnos, tra bod yr RNA a dynnwyd o ddueg llygod mawr wedi aros yn sefydlog ar ôl cael ei storio mewn dŵr am 3 blynedd.Yn ogystal, mae trawsgrifiadau sy'n hwy na 4 kb yn fwy sensitif i ddiraddiad trwy RNAses olrhain na thrawsgrifiadau bach.Er mwyn cynyddu sefydlogrwydd samplau RNA sydd wedi'u storio, gellir hydoddi RNA mewn formamid deionized a'i storio ar -70 ° C.Rhaid i fforamid a ddefnyddir i gadw RNA fod yn rhydd o falurion sy'n diraddio RNA.Gellir cadw RNA o'r pancreas mewn formamid am o leiaf blwyddyn.Wrth baratoi i ddefnyddio RNA, gallwch ddefnyddio'r dull canlynol i waddodi RNA: ychwanegu NaCl at 0.2M a 4 gwaith cyfaint ethanol, gosod ar dymheredd ystafell am 3-5 munud, a centrifuge ar 10,000 × g am 5 munud.

2. Defnyddiwch y trawsgrifiad cefn RNaseH-anactif (RNaseH-):

Mae atalyddion RNase yn aml yn cael eu hychwanegu at adweithiau trawsgrifio gwrthdro i gynyddu hyd a chynnyrch synthesis cDNA.Dylid ychwanegu atalyddion RNase yn ystod yr adwaith synthesis llinyn cyntaf ym mhresenoldeb byffer ac asiant lleihau (fel DTT), oherwydd bod y broses cyn synthesis cDNA yn dadnatureiddio'r atalydd, gan ryddhau RNase rhwymedig a all ddiraddio RNA.Mae atalyddion RNase protein yn atal diraddio RNA gan RNase A, B, C yn unig, ac nid ydynt yn atal RNase ar y croen, felly byddwch yn ofalus i beidio â chyflwyno RNase o'ch bysedd er gwaethaf y defnydd o'r atalyddion hyn.

Mae transcriptase gwrthdro yn cataleiddio trosi RNA i cDNA.Mae gan M-MLV ac AMV weithgaredd RNaseH mewndarddol yn ogystal â'u gweithgaredd polymeras eu hunain.Mae gweithgaredd RNaseH a gweithgaredd polymeras yn cystadlu â'i gilydd am y llinyn hybrid a ffurfiwyd rhwng y templed RNA a'r preimiwr DNA neu edefyn estyniad cDNA, ac yn diraddio'r llinyn RNA yn y cymhlyg RNA:DNA.Ni all y templed RNA sydd wedi'i ddiraddio gan weithgaredd RNaseH bellach fod yn swbstrad effeithiol ar gyfer synthesis cDNA, sy'n lleihau cynnyrch a hyd synthesis cDNA.Felly, byddai'n fuddiol dileu neu leihau'n fawr weithgaredd RNaseH trawsgrifiad gwrthdro.。

Gall SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase a thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, gael mwy o swm a mwy o cDNA hyd llawn na MMLV ac AMV.Bydd sensitifrwydd RT-PCR yn cael ei effeithio gan faint o synthesis cDNA.Mae ThermoScript yn llawer mwy sensitif nag AMV.Mae maint cynhyrchion RT-PCR wedi'i gyfyngu gan allu trawsgrifiad gwrthdro i syntheseiddio cDNA, yn enwedig wrth glonio cDNAs mwy.O'i gymharu â MMLV, cynyddodd SuperScripⅡ gynnyrch cynhyrchion RT-PCR hir yn sylweddol.Mae'r transcriptase RNaseH-cefn hefyd wedi cynyddu thermostability, felly gall yr adwaith gael ei berfformio ar dymheredd uwch na'r arferol 37-42 ° C.O dan yr amodau synthesis a awgrymir, defnyddiwch primer oligo(dT) a 10 μCi o [α-P]dCTP.Cyfrifwyd cyfanswm cynnyrch y gainc gyntaf gan ddefnyddio dull dyddodiad TCA.Dadansoddwyd cDNA hyd llawn gan ddefnyddio bandiau wedi'u didoli mewn maint wedi'u tynnu allan a'u cyfrif ar gel agarose alcalïaidd.

3. Codwch y tymheredd deori ar gyfer trawsgrifio gwrthdro:

Mae tymheredd deor uwch yn helpu i agor y strwythur eilaidd RNA, gan gynyddu cynnyrch yr adwaith.Ar gyfer y rhan fwyaf o dempledi RNA, bydd deor yr RNA a'r paent preimio ar 65 ° C heb glustogi na halen, ac yna oeri cyflym ar rew yn dileu'r rhan fwyaf o strwythurau eilaidd ac yn caniatáu i breimwyr rwymo.Fodd bynnag, mae gan rai templedi strwythurau eilaidd o hyd, hyd yn oed ar ôl dadnatureiddio gwres.Gellir ehangu'r templedi anodd hyn gan ddefnyddio ThermoScript Reverse Transcriptase a gosod yr adwaith trawsgrifio gwrthdro ar dymheredd uwch i wella ymhelaethu.Gall tymereddau deori uwch hefyd gynyddu penodoldeb, yn enwedig pan ddefnyddir preimwyr genyn-benodol (GSP) ar gyfer synthesis cDNA (gweler Pennod 3).Os ydych chi'n defnyddio GSP, sicrhewch fod Tm y paent preimio yr un fath â'r tymheredd deori disgwyliedig.Peidiwch â defnyddio paent preimio oligo(dT) ac ar hap uwchlaw 60°C.Mae angen deori preimwyr ar hap ar 25°C am 10 munud cyn cynyddu i 60°C.Yn ogystal â defnyddio tymheredd trawsgrifio gwrthdroi uwch, gellir gwella penodoldeb hefyd trwy drosglwyddo'r cymysgedd RNA/primer yn uniongyrchol o'r tymheredd dadnatureiddio 65 ° C i'r tymheredd deori trawsgrifio cefn ac ychwanegu cymysgedd adwaith 2 × wedi'i gynhesu ymlaen llaw (synthesis cychwyn poeth cDNA).Mae'r dull hwn yn helpu i atal y paru sylfaen rhyngfoleciwlaidd sy'n digwydd ar dymheredd is.Gellir symleiddio'r newid tymheredd lluosog sydd ei angen ar gyfer RT-PCR trwy ddefnyddio beiciwr thermol.

Mae tth polymeras thermostable yn gweithredu fel polymeras DNA ym mhresenoldeb Mg2+ ac fel polymeras RNA ym mhresenoldeb Mn2+.Gellir ei gadw'n gynnes ar dymheredd uchaf o 65 ° C.Fodd bynnag, mae presenoldeb Mn2+ yn ystod PCR yn lleihau ffyddlondeb, sy'n gwneud Tth polymeras yn llai addas ar gyfer ymhelaethu manwl uchel, megis clonio cDNA.Yn ogystal, mae gan Tth effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro isel, sy'n lleihau sensitifrwydd, a, gan y gellir perfformio trawsgrifiad gwrthdro a PCR gydag un ensym, ni ellir defnyddio adweithiau rheoli heb drawsgrifio gwrthdro i gymharu cynhyrchion mwyhau cDNA â DNA genomig llygru.Gwahanwyd y cynhyrchion ymhelaethu.

4. Ychwanegion sy'n hyrwyddo trawsgrifio gwrthdro:

Mae ychwanegion gan gynnwys glyserol a DMSO yn cael eu hychwanegu at yr adwaith synthesis llinyn cyntaf, a all leihau sefydlogrwydd llinyn dwbl asid niwclëig a datglymu strwythur eilaidd RNA.Gellir ychwanegu hyd at 20% glyserol neu 10% DMSO heb effeithio ar weithgaredd SuperScript II neu MMLV.Gall AMV hefyd oddef hyd at 20% glyserol heb golli gweithgaredd.Er mwyn cynyddu sensitifrwydd RT-PCR yn yr adwaith trawsgrifio cefn SuperScriptⅡ, gellir ychwanegu glyserol 10% a'i ddeor ar 45 ° C.Os ychwanegir 1/10 o'r cynnyrch adwaith trawsgrifio gwrthdro at PCR, yna mae crynodiad glyserol yn yr adwaith mwyhau yn 0.4%, nad yw'n ddigon i atal PCR.

5. RNaseH trin:

Gall trin adweithiau synthesis cDNA gyda RNaseH cyn PCR gynyddu sensitifrwydd.Ar gyfer rhai templedi, credir bod RNA yn yr adwaith synthesis cDNA yn atal rhwymo cynhyrchion ymhelaethu, ac os felly gall triniaeth RNaseH gynyddu sensitifrwydd.Yn gyffredinol, mae angen triniaeth RNaseH wrth ymhelaethu ar dempledi targed cDNA hyd llawn hirach, fel scherosis twberaidd copi isel II.Ar gyfer y templed anodd hwn, roedd triniaeth RNaseH yn gwella'r signal a gynhyrchwyd gan SuperScript II neu cDNA wedi'i syntheseiddio gan AMV.Ar gyfer y rhan fwyaf o adweithiau RT-PCR, mae triniaeth RNaseH yn ddewisol, oherwydd bod y cam dadnatureiddio PCR ar 95 ° C yn gyffredinol yn hydrolysu'r RNA yn y cyfadeilad RNA:DNA.

6. Gwella Dull Canfod RNA Bach:

Mae RT-PCR yn arbennig o heriol pan mai dim ond symiau bach o RNA sydd ar gael.Mae glycogen a ychwanegir fel cludwr yn ystod ynysu RNA yn helpu i gynyddu cynnyrch samplau bach.Gellir ychwanegu glycogen di-RNase ar yr un pryd ag ychwanegu Trizol.Mae glycogen yn hydawdd mewn dŵr a gellir ei gadw yn y cyfnod dyfrllyd gyda RNA i gynorthwyo dyddodiad dilynol.Ar gyfer samplau llai na 50 mg o feinwe neu 106 o gelloedd diwylliedig, y crynodiad a argymhellir o glycogen di-RNase yw 250 μg/ml.

Gall ychwanegu BSA acetylated i'r adwaith trawsgrifio cefn gan ddefnyddio SuperScript II gynyddu'r sensitifrwydd, ac ar gyfer symiau bach o RNA, gall lleihau faint o SuperScript II ac ychwanegu 40 uned o atalydd niwcleas RNaseOut gynyddu lefel y canfod.Os defnyddir glycogen yn y broses ynysu RNA, mae'n dal i gael ei argymell i ychwanegu atalydd BSA neu RNase wrth ddefnyddio SuperScript II ar gyfer adwaith trawsgrifio gwrthdro.

二 、 Cynyddu penodolrwydd RT-PCR

1. Asynthesis CND:

Gellir cychwyn synthesis cDNA llinyn cyntaf gan ddefnyddio tri dull gwahanol, y mae eu penodoldeb cymharol yn effeithio ar faint a math o cDNA wedi'i syntheseiddio.

Y dull preimio ar hap oedd y lleiaf penodol o'r tri dull.Mae preimwyr yn anelio mewn sawl safle trwy gydol y trawsgrifiad, gan gynhyrchu cDNAs byr, rhannol hyd.Defnyddir y dull hwn yn aml i gael dilyniannau diwedd 5′ ac i gael cDNA o dempledi RNA gyda rhanbarthau o strwythur eilaidd neu gyda safleoedd terfynu na ellir eu hailadrodd gan transcriptase gwrthdro.Er mwyn cael y cDNA hiraf, mae angen pennu cymhareb y paent preimio i RNA ym mhob sampl RNA yn empirig.Roedd crynodiad cychwynnol y preimwyr ar hap yn amrywio o 50 i 250 ng fesul 20 μl adwaith.Gan fod cDNA wedi'i syntheseiddio o gyfanswm RNA gan ddefnyddio paent preimio ar hap yn RNA ribosomaidd yn bennaf, mae poly(A) + RNA yn cael ei ddewis yn gyffredinol fel y templed.

Mae paent preimio Oligo(dT) yn fwy penodol na rhai preimio ar hap.Mae'n croesrywio i'r gynffon poly(A) a geir ar ben 3′ y rhan fwyaf o mRNAs ewcaryotig.Oherwydd bod poly(A)+ RNA tua 1% i 2% o gyfanswm yr RNA, mae maint a chymhlethdod cDNA yn llawer llai na gyda phaent preimio ar hap.Oherwydd ei benodolrwydd uchel, yn gyffredinol nid yw oligo(dT) yn gofyn am optimeiddio'r gymhareb RNA i preimwyr a detholiad poly(A)+.Argymhellir defnyddio 0.5μg oligo(dT) fesul system adwaith 20μl.Mae oligo(dT)12-18 yn addas ar gyfer y rhan fwyaf o RT-PCR.Mae System RT-PCR ThermoScript yn cynnig oligo(dT)20 oherwydd ei sefydlogrwydd thermol gwell ar gyfer tymereddau deori uwch.

Preimwyr genynnau penodol (GSP) yw'r preimwyr mwyaf penodol ar gyfer y cam trawsgrifio cefn.Mae GSP yn oligonucleotid antisense a all groesi'n benodol i'r dilyniant targed RNA, yn wahanol i breimwyr ar hap neu oligo(dT), sy'n anelio i bob RNA.Mae'r un rheolau a ddefnyddir i ddylunio paent preimio PCR yn berthnasol i ddyluniad GSP mewn adweithiau trawsgrifio gwrthdro.Gall y GSP fod yr un dilyniant â'r preimiwr ymhelaethu sy'n anelio i ben 3′-mwyaf yr mRNA, neu gellir dylunio'r GSP i anelio i lawr yr afon o'r preimiwr mwyhadu gwrthdro.Ar gyfer rhai pynciau chwyddedig, mae angen dylunio mwy nag un paent preimio antisense ar gyfer RT-PCR llwyddiannus oherwydd gall strwythur eilaidd yr RNA targed atal rhwymo paent preimio.Argymhellir defnyddio GSP antisense 1 pmol mewn adwaith synthesis llinyn cyntaf 20 μl.

2. Codwch y tymheredd deori ar gyfer trawsgrifio gwrthdro:

Er mwyn manteisio i'r eithaf ar y fantais lawn o benodolrwydd GSP, dylid defnyddio trawsgrifiad gwrthdro gyda thermosefydlogrwydd uwch.Gellir deor trawsgrifiadau gwrthdro thermomedrol ar dymheredd uwch i gynyddu llymder adwaith.Er enghraifft, os yw GSP yn anelio ar 55°C, ni fydd penodoldeb y GSP yn cael ei ddefnyddio’n llawn os defnyddir AMV neu M-MLV ar gyfer trawsgrifio o chwith gyda llymder isel o 37°C.Fodd bynnag, gellir adweithio SuperScript II a ThermoScript ar 50 ° C neu uwch, a fydd yn dileu cynhyrchion amhenodol a gynhyrchir ar dymheredd is.I gael y penodolrwydd mwyaf, gellir trosglwyddo'r cymysgedd RNA/primer yn uniongyrchol o'r tymheredd dadnatureiddio 65 ° C i'r tymheredd deori trawsgrifio cefn a'i ychwanegu at gymysgedd adwaith 2 × wedi'i gynhesu ymlaen llaw (cychwyn poeth synthesis cDNA).Mae hyn yn helpu i atal paru sylfaen rhyngfoleciwlaidd ar dymheredd isel.Gellir symleiddio'r trawsnewidiadau tymheredd lluosog sy'n ofynnol ar gyfer RT-PCR trwy ddefnyddio beiciwr thermol.

3. Yn lleihau halogiad DNA genomig:

Anhawster posibl gyda RT-PCR yw halogiad DNA genomig yn yr RNA.Bydd defnyddio dull ynysu RNA da, fel Trizol Reagent, yn lleihau faint o DNA genomig sy'n halogi'r paratoad RNA.Er mwyn osgoi cynhyrchion sy'n deillio o DNA genomig, gellir trin RNA â gradd chwyddo DNase I i gael gwared ar DNA halogedig cyn trawsgrifio gwrthdro.Daeth treuliad DNA I i ben trwy ddeor y samplau mewn EDTA 2.0 mM am 10 munud ar 65°C.Gall EDTA chelate ïonau magnesiwm, atal hydrolysis RNA magnesiwm-ddibynnol ar dymheredd uchel.

Er mwyn gwahanu cDNA chwyddedig oddi wrth halogi cynhyrchion genomig mwyhau DNA, gellir dylunio paent preimio bod pob anelio i wahanu exons.Bydd cynhyrchion PCR sy'n deillio o cDNA yn fyrrach na'r rhai sy'n deillio o DNA genomig halogedig.Yn ogystal, cynhaliwyd arbrawf rheoli heb drawsgrifio gwrthdro ar bob templed RNA i benderfynu a oedd darn penodol yn deillio o DNA genomig neu cDNA.Mae'r cynnyrch PCR a geir heb drawsgrifiad gwrthdro yn deillio o'r genom.