Ⅰ. Cynyddu sensitifrwydd y system adwaith:
1. RNA o ansawdd uchel ar wahân:
Daw synthesis cDNA llwyddiannus o RNA o ansawdd uchel.Dylai RNA o ansawdd uchel sicrhau cyfanswm hirach o leiaf ac nid yw'n cynnwys atalyddion nad ydynt yn cynnwys ensymau recordio, megis EDTA neu SDS.Mae ansawdd RNA yn pennu gwerth mwyaf y wybodaeth dilyniant y gallwch ei thrawsgrifio i'r cDNA.Mae'r dull puro RNA cyffredinol yn ddull cam o ddefnyddio isoocyanate / asidophenol.Er mwyn atal llygredd RNase, mae'r RNA sydd wedi'i wahanu o sampl sy'n gyfoethog mewn RNase (fel pancreas) yn gofyn am storio fformaldehyd i arbed RNA o ansawdd uchel, sydd hyd yn oed yn fwy felly ar gyfer storio hirdymor.Yn y bôn, diraddiwyd yr RNA a dynnwyd o'r afu llygod mawr ar ôl wythnos o storio mewn dŵr, tra bod yr RNA a echdynnwyd o ddueg y llygoden fawr wedi aros yn sefydlog ar ôl tair blynedd o storio mewn dŵr.Yn ogystal, mae trawsgrifiadau mwy na 4kb yn fwy sensitif i olrhain diraddiad RNase na thrawsgrifiadau bach.Er mwyn cynyddu sefydlogrwydd y sampl RNA storio, gellir hydoddi'r RNA mewn methalmamine o ïon, a'i storio -70 ° C.Ni ddylai thylid a ddefnyddir i arbed RNA gynnwys gwrthrych amrywiol sy'n diraddio RNA.Gellir arbed RNA, sy'n deillio o'r pancreas, mewn methalmamine am o leiaf blwyddyn.Pan fyddwch chi'n barod i ddefnyddio RNA, gallwch ddefnyddio'r dulliau canlynol i waddodi RNA: ychwanegu NaCl i 0.2m a 4 gwaith cyfaint yr ethanol, gosod tymheredd yr ystafell am 3-5 munud, a 10,000 × g allgyrchol am 5 munud.
2. Defnyddio trawsgrifiad cefn heb weithgaredd RNaseH (RNaseH-):
Mae atalyddion RNase yn aml yn cael eu hychwanegu at adweithiau trawsgrifio gwrthdro i gynyddu hyd a chynnyrch synthesis cDNA.Ychwanegir atalydd RNase yn yr adwaith synthesis cadwyn cyntaf ym mhresenoldeb byfferau a chyfryngau lleihau megis DTT oherwydd bod y broses synthesis cyn-cDNA yn dadnatureiddio'r atalydd, a thrwy hynny yn rhyddhau RNases rhwymedig sy'n diraddio RNA.Protein RNase atalydd dim ond atal diraddio RNA gan RNAse A, B, C, ac nid ydynt yn atal RNase ar y croen, felly dylid cymryd gofal i beidio â chyflwyno RNAses o'r bysedd er gwaethaf y defnydd o atalyddion hyn.
Mae transcriptase gwrthdro yn cataleiddio trosi RNA yn cDNA.Mae gan M-MLV ac AMV weithgaredd RNaseH mewndarddol yn ogystal â'u gweithgaredd polymeras eu hunain.Mae gweithgaredd RNaseH yn cystadlu â gweithgaredd polymeras ar gyfer llinynnau heterosygaidd a ffurfiwyd rhwng templedi RNA a preimwyr DNA neu linynnau estyn cDNA, ac yn diraddio RNA: llinynnau RNA mewn cymhlygion DNA.Ni ellir bellach ddefnyddio templedi RNA sydd wedi'u diraddio gan weithgarwch RNaseH fel swbstradau effeithiol ar gyfer synthesis cDNA, gan leihau cynnyrch a hyd synthesis cDNA.Felly byddai dileu neu leihau gweithgarwch RNaseH yn sylweddol o drawsgrifiad gwrthdro o fudd mawr.
Cynhyrchodd trawsgrifiad cefn SuperScriptⅡ, trawsgrifiad cefn MMLV o RNaseH- a thrawsgrifiad gwrthdro thermoScript, AMV o RNaseH- fwy o cDNA hyd llawn na MMLV ac AMV.Mae sensitifrwydd RT-PCR yn cael ei effeithio gan faint o cDNA wedi'i syntheseiddio.Mae ThermoScript yn llawer mwy sensitif nag AMV.Mae maint cynhyrchion RT-PCR wedi'i gyfyngu gan allu trawsgrifiad gwrthdro i syntheseiddio cDNA, yn enwedig wrth glonio Cdnas mwy.O'i gymharu â MMLV, cynyddodd SuperScripⅡ gynnyrch cynhyrchion RT-PCR hir yn sylweddol.Mae transcriptase cefn RNaseH- hefyd yn cynyddu sefydlogrwydd thermol, felly gellir cynnal yr adwaith ar dymheredd uwch na'r arfer o 37-42 ℃.O dan yr amodau synthesis a awgrymwyd, defnyddiwyd paent preimio oligo(dT) a 10μCi [alpha-p]dCTP.Cyfrifwyd cyfanswm cynhyrchiad y gadwyn gyntaf gan ddefnyddio dull dyddodiad TCA.Dadansoddwyd cDNA hyd llawn gan ddefnyddio tynnu stribedi wedi'u didoli mewn maint a chyfrif mewn gel agarose alcalïaidd.
3. Cynyddu tymheredd cadw gwres trawsgrifio gwrthdro:
Mae tymheredd dal uwch yn helpu i agor strwythur eilaidd RNA a chynyddu cynnyrch yr adwaith.Ar gyfer y rhan fwyaf o dempledi RNA, mae dal yr RNA a'r paent preimio ar 65 ° C heb glustogi na halen ac yna eu hoeri'n gyflym ar rew yn dileu'r rhan fwyaf o strwythurau eilaidd ac yn caniatáu i'r paent preimio rwymo.Fodd bynnag, mae gan rai templedi strwythur eilaidd o hyd, hyd yn oed ar ôl dadnatureiddio thermol.Gellir ymhelaethu ar y templedi anodd hyn gan ddefnyddio trawsgrifiad gwrthdro ThermoScript a thrwy osod yr adwaith transcriptase cefn ar dymheredd uwch i wella ymhelaethu.Gall tymereddau dal uwch hefyd gynyddu penodoldeb, yn enwedig pan fydd synthesis cDNA yn cael ei berfformio gan ddefnyddio paent preimio genyn-benodol (GSPS) (gweler Pennod 3).Os ydych chi'n defnyddio GSP, gwnewch yn siŵr bod gwerth Tm y paent preimio yr un fath â'r tymheredd dal disgwyliedig.Peidiwch â defnyddio paent preimio oligo (dT) ac ar hap uwchlaw 60 ℃.Mae angen cynnal paent preimio ar hap ar 25 ℃ am 10 munud cyn cynyddu i 60 ℃.Yn ogystal â defnyddio tymereddau trawsgrifio gwrthdro uwch, gellir gwella penodoldeb trwy drosglwyddo'r cymysgedd RNA / primer yn uniongyrchol o'r tymheredd dadnatureiddio 65 ℃ i'r tymheredd dal trawsgrifio cefn ac ychwanegu cymysgedd adwaith 2 × wedi'i gynhesu ymlaen llaw (synthesis cychwyn thermol cDNA).Mae'r dull hwn yn helpu i atal y paru sylfaen rhyngfoleciwlaidd sy'n digwydd ar dymheredd is.Mae defnyddio offeryn PCR yn symleiddio'r nifer o switshis tymheredd sydd eu hangen ar gyfer RT-PCR.
Mae polymeras sefydlogi gwres Tth yn gweithredu fel DNA polymeras ym mhresenoldeb Mg2+ ac RNA polymeras ym mhresenoldeb Mn2+.Gall ddal gwres hyd at 65 ℃.Fodd bynnag, mae presenoldeb Mn2+ yn ystod PCR yn lleihau ffyddlondeb, sy'n gwneud Tth polymeras yn llai addas ar gyfer ymhelaethu manwl uchel, megis clonio cDNA.Yn ogystal, mae Tth yn llai effeithlon wrth drawsgrifio gwrthdro, sy'n lleihau sensitifrwydd, a chan y gall ensym sengl berfformio trawsgrifiad gwrthdro a PCR, ni ellir defnyddio adweithiau rheoli heb drawsgrifio gwrthdro i wahaniaethu rhwng cynhyrchion chwyddedig cDNA a rhai DNA genomig halogedig.
4. Ychwanegyn sy'n hyrwyddo trawsgrifio gwrthdro:
Gall ychwanegu ychwanegion, gan gynnwys glyserin a DMSO, i'r adwaith synthesis cadwyn gyntaf leihau sefydlogrwydd llinyn dwbl asid niwclëig a dad-ddirwyn strwythur eilaidd RNA.Gellir ychwanegu hyd at 20% glyserin neu 10% DMSO heb effeithio ar weithgaredd SuperScriptⅡ neu MMLV.Gall AMV hefyd oddef hyd at 20% glyserol heb leihau gweithgaredd.Er mwyn cynyddu sensitifrwydd RT-PCR mewn adwaith trawsgrifio gwrthdro SuperScriptⅡ, gellir ychwanegu 10% glyserol a'i inswleiddio ar 45 ℃.Os ychwanegir 1/10 o'r cynnyrch adwaith ôl-drawsysgrifio at y PCR, y crynodiad o glyserol yn yr adwaith mwyhau yw 0.4%, nad yw'n ddigon i atal PCR.
5. RNaseH prosesu:
Gellir gwella sensitifrwydd trwy drin adweithiau synthesis cDNA ag RNaseH cyn PCR.Ar gyfer rhai templedi, credir bod yr RNA yn yr adwaith synthesis cDNA yn atal rhwymo cynhyrchion chwyddedig, ac os felly gall y driniaeth RNaseH gynyddu sensitifrwydd.Yn gyffredinol, mae angen triniaeth RNaseH ar gyfer ymhelaethu ar dempled targed cDNA hyd llawn cymharol hir, fel scherosis twberusⅡ gyda chopi isel.Ar gyfer y templed anodd hwn, fe wnaeth RNaseH wella'r signal a gynhyrchir gan y cDNA wedi'i syntheseiddio gan SuperScriptⅡ neu AMV.Ar gyfer y rhan fwyaf o adweithiau RT-PCR, mae'r driniaeth RNaseH yn ddewisol oherwydd bod y cam dadnatureiddio PCR wedi'i inswleiddio 95 ℃ fel arfer yn hydrolysu'r RNA o'r cymhleth RNA: DNA.
6. Gwell dulliau ar gyfer canfod symiau bach o RNA:
Mae RT-PCR yn arbennig o heriol pan mai dim ond symiau bach o RNA sydd ar gael.Mae ychwanegu glycogen fel cludwr yn ystod gwahaniad RNA yn helpu i gynyddu cynnyrch samplau bach.Gellir ychwanegu glycogen di-RNase ar yr un pryd â Trizol.Mae glycogen yn hydawdd mewn dŵr a gall aros yn y cyfnod dŵr gydag RNA i gynorthwyo gyda dyodiad dilynol.Y crynodiad a argymhellir o glycogen di-RNase yw 250μg/ml ar gyfer samplau llai na 50mg o feinwe neu 106 o gelloedd diwylliedig.
Gall ychwanegu BSA acetylated i wrthdroi adweithiau trawsgrifio gan ddefnyddio SuperScriptⅡ gynyddu'r sensitifrwydd, ac ar gyfer symiau bach o RNA, gall lleihau faint o SuperScriptⅡ ac ychwanegu 40 uned o atalydd niwcleas RnaseOut wella'r lefel ganfod.Os defnyddir glycogen wrth wahanu RNA, argymhellir ychwanegu atalyddion BSA neu RNase i wrthdroi adweithiau trawsgrifio gan ddefnyddio SuperScriptⅡ.
Ⅱ. Cynyddu penodoldeb RT-PCR
1. synthesis cNDA:
Gellir defnyddio tri dull gwahanol i gychwyn synthesis cDNA llinyn cyntaf, ac mae penodoldeb cymharol pob dull yn effeithio ar faint a math o cDNA wedi'i syntheseiddio.
Dull preimio ar hap yw'r lleiaf penodol o'r tri dull.Mae preimwyr yn cael eu hanelio mewn sawl safle trwy gydol y trawsgrifiad i gynhyrchu cDNA o hyd rhannol, byr.Defnyddir y dull hwn yn aml i gael dilyniannau terfynell 5′ a cDNA o dempledi RNA gyda rhanbarthau strwythurol eilaidd neu gyda safleoedd terfynu na all trawsgrifiad gwrthdroi eu hailadrodd.Er mwyn cael y cDNA hiraf, mae angen pennu cymhareb y paent preimio i RNA ym mhob sampl RNA yn empirig.Mae crynodiad cychwynnol preimwyr ar hap yn amrywio o 50 i 250ng fesul system adwaith 20μl.Oherwydd bod y cDNA sy'n cael ei syntheseiddio o gyfanswm RNA gan ddefnyddio paent preimio ar hap yn RNA ribosomaidd yn bennaf, mae poly(A)+RNA yn cael ei ddewis yn gyffredinol fel y templed.
Mae cychwyn Oligo(dT) yn fwy penodol na phrimwyr ar hap.Mae'n croesrywio â'r gynffon poly(A) a geir ar ben 3′ mRNA yn y rhan fwyaf o gelloedd ewcaryotig.Oherwydd bod poly(A)+RNA tua 1% i 2% o gyfanswm yr RNA, mae maint a chymhlethdod cDNA yn llawer llai na phe bai paent preimio ar hap yn cael ei ddefnyddio.Oherwydd ei benodolrwydd uchel, yn gyffredinol nid yw oligo(dT) yn gofyn am optimeiddio ar gyfer cymhareb RNA i preimio a dewis poly(A)+.Argymhellir defnyddio 0.5μg oligo(dT) fesul system adwaith 20μl.Mae oligo(dT)12-18 yn addas ar gyfer y rhan fwyaf o RT-PCR.Mae ThermoScript RT-PCR System yn darparu oligo(dT)20 oherwydd ei sefydlogrwydd thermol da ac mae'n addas ar gyfer tymereddau dal uwch.
Preimio genynnau-benodol (GSP) yw'r paent preimio penodol gorau ar gyfer y cam trawsgrifio cefn.Mae GSP yn oligonucleoside antisense sy'n gallu croesrywio'n benodol â dilyniannau cyrchfan RNA, yn hytrach na anelio pob Rnas fel paent preimio ar hap neu oligo(dT).Mae'r rheolau a ddefnyddir i ddylunio paent preimio PCR hefyd yn berthnasol i ddyluniad adwaith trawsgrifio gwrthdro GSP.Gall GSP fod yr un dilyniant â'r preimiwr ymhelaethu sydd wedi'i anelio ar ddiwedd mRNA3′, neu gellir dylunio GSP i'w anelio i lawr yr afon gyda'r paent preimio mwyhau gwrthdro.Ar gyfer rhai gwrthrychau chwyddedig, mae angen dylunio mwy nag un paent preimio antisense ar gyfer RT-PCR llwyddiannus oherwydd gall strwythur eilaidd yr RNA targed atal y paent preimio rhag rhwymo.Awgrymir defnyddio GSP antisense 1pmol yn y system adwaith synthesis cadwyn gyntaf o 20μl.
2. Cynyddu tymheredd cadw gwres trawsgrifio gwrthdro:
Er mwyn manteisio'n llawn ar benodolrwydd GSP, dylid defnyddio transcriptase gwrthdro gyda sefydlogrwydd thermol uchel.Gellir insiwleiddio trawsgrifiad gwrthdroi gwres-sefydlog ar dymheredd uwch i gynyddu trylwyredd adwaith.Er enghraifft, os yw GSP yn cael ei anelio ar 55°C, yna ni ddefnyddir penodoldeb GSP yn llawn os cyflawnir trawsgrifiad o chwith ar 37°C gyda thrylwyredd isel gan ddefnyddio AMV neu M-MLV.Fodd bynnag, gall SuperScripⅡ a ThermoScript ymateb ar 50 ℃ neu uwch, sy'n dileu cynhyrchion amhenodol a gynhyrchir ar dymheredd is.Er mwyn sicrhau'r penodolrwydd mwyaf, gellir trosglwyddo'r cymysgedd RNA / paent preimio yn uniongyrchol o'r tymheredd dadnatureiddio 65 ℃ i'r tymheredd dal trawsgrifio cefn gan ychwanegu cymysgedd adwaith 2 x wedi'i gynhesu ymlaen llaw (cychwyn synthesis cDNA yn thermol).Mae hyn yn helpu i atal paru sylfaen rhwng moleciwlau ar dymheredd isel.Mae defnyddio offeryn PCR yn symleiddio'r trawsnewidiadau tymheredd niferus sydd eu hangen ar gyfer RT-PCR.
3. Lleihau halogiad DNA genomig:
Un anhawster posibl gyda RT-PCR yw bod RNA yn halogi DNA genomig.Mae defnyddio dulliau gwahanu RNA gwell, fel Trizol Reagent, yn lleihau halogiad DNA genomig mewn paratoadau RNA.Er mwyn osgoi cynhyrchion a gynhyrchir o DNA genomig, gellir trin yr RNA â gradd ymhelaethu DnasⅠ i gael gwared ar DNA halogedig cyn trawsgrifio gwrthdro.Cadwyd y samplau ar 65 ℃ mewn EDTA 2.0mM am 10 munud i derfynu treuliad DNaseⅠ.Mae EDTA yn celu ïonau magnesiwm i atal yr hydrolysis RNA sy'n ddibynnol ar ïon magnesiwm sy'n digwydd ar dymheredd uchel.
Er mwyn gwahanu cDNA chwyddedig oddi wrth y cynnyrch chwyddo DNA genom, gellir dylunio paent preimio sy'n anelio ar wahân gyda'r exon wedi'i wahanu.Bydd cynhyrchion PCR sy'n deillio o cDNA yn fyrrach na'r rhai sy'n deillio o DNA genomig halogedig.Mae arbrawf rheoledig heb drawsgrifio gwrthdro hefyd yn cael ei berfformio ar bob templed RNA i benderfynu a yw darn penodol yn dod o DNA genomig neu cDNA.Mae cynhyrchion PCR a geir yn absenoldeb trawsgrifiad gwrthdro yn deillio o'r genom.
Cynnyrch Cysylltiedig
-Mae'r pecyn un cam yn galluogi trawsgrifio gwrthdro a PCR i gael ei wneud yn yr un tiwb.Nid oes ond angen ychwanegu RNA templed, paent preimio PCR penodol a ddH Di-RNase2O.
-Gellir cynnal dadansoddiad meintiol amser real o RNA yn gyflym ac yn gywir.
-Mae'r pecyn yn defnyddio adweithydd trawsgrifio gwrthdro Foregene unigryw a Polymerase DNA Foregene HotStar Taq ynghyd â system adwaith unigryw i wella effeithlonrwydd mwyhau a phenodoldeb yr adwaith yn effeithiol.
-Mae'r system adwaith optimaidd yn golygu bod gan yr adwaith sensitifrwydd canfod uwch, sefydlogrwydd thermol cryfach, a goddefgarwch gwell.
-Gallu effeithlon i gael gwared ar gDNA, a all gael gwared ar gDNA yn y templed o fewn 2 funud.
-System trawsgrifio gwrthdro effeithlon, dim ond 15 munud y mae'n ei gymryd i gwblhau synthesis cDNA llinyn cyntaf.
-Templedi cymhleth: gellir gwrthdroi templedi gyda chynnwys GC uchel a strwythur eilaidd cymhleth hefyd gydag effeithlonrwydd uchel.
-System trawsgrifio gwrthdro sensitifrwydd uchel, gall templedi lefel td hefyd gael cDNA o ansawdd uchel.
-Mae gan y system trawsgrifio gwrthdro sefydlogrwydd thermol uchel, y tymheredd adwaith gorau posibl yw 42 ℃, ac mae ganddi berfformiad trawsgrifio cefn da o hyd ar 50 ℃.
Amser post: Mar-07-2023
