1. Gwybodaeth sylfaenol (os ydych chi am weld y rhan arbrofol, trosglwyddwch yn uniongyrchol i'r ail ran)
Fel adwaith deilliadol o PCR confensiynol, mae PCR amser real yn bennaf yn monitro newid maint y cynnyrch ymhelaethu ym mhob cylch o'r adwaith mwyhau PCR mewn amser real trwy newid y signal fflworoleuedd, ac yn dadansoddi'r templed cychwyn yn feintiol trwy'r berthynas rhwng y gwerth ct a'r gromlin safonol.
Mae data penodol RT-PCR yngwaelodlin, trothwy fflworoleueddagwerth Ct.
| gwaelodlin: | Gwerth fflworoleuedd y 3ydd-15fed cylch yw'r llinell sylfaen (gwaelodlin), a achosir gan gamgymeriad achlysurol y mesuriad. |
| Trothwy (trothwy): | Yn cyfeirio at y terfyn canfod fflworoleuedd a osodwyd mewn safle priodol yn rhanbarth twf esbonyddol y gromlin ymhelaethu, yn gyffredinol 10 gwaith gwyriad safonol y llinell sylfaen. |
| Gwerth CT: | Dyma nifer y cylchoedd PCR pan fydd y gwerth fflworoleuedd ym mhob tiwb adwaith yn cyrraedd y trothwy. Mae'r gwerth Ct mewn cyfrannedd gwrthdro â swm y templed cychwynnol. |
Dulliau labelu cyffredin ar gyfer RT-PCR:
| dull | Mantais | diffyg | cwmpas y cais |
| SYBR GwyrddⅠ | Cymhwysedd eang, sensitif, rhad a chyfleus | Mae gofynion primer yn uchel, yn dueddol o gael bandiau amhenodol | Mae'n addas ar gyfer dadansoddiad meintiol o wahanol enynnau targed, ymchwil ar fynegiant genynnau, ac ymchwil ar anifeiliaid a phlanhigion trawsgenig ailgyfunol. |
| TaqMan | Penodoldeb da ac ailadroddadwyedd uchel | Mae'r pris yn uchel a dim ond yn addas ar gyfer nodau penodol. | Canfod pathogenau, ymchwil genynnau ymwrthedd cyffuriau, asesiad effeithiolrwydd cyffuriau, diagnosis o glefydau genetig. |
| beacon moleciwlaidd | Penodoldeb uchel, fflworoleuedd, cefndir isel | Mae'r pris yn uchel, dim ond at ddiben penodol y mae'n addas, mae'r dyluniad yn anodd, ac mae'r pris yn uchel. | Dadansoddiad genynnau penodol, dadansoddiad SNP |
2. Camau arbrofol
2.1 Am y grwpio arbrofol- rhaid cael ffynhonnau lluosog yn y grŵp, a rhaid cael ailadroddiadau biolegol.
| ① | Rheolaeth wag | Fe'i defnyddir i ganfod statws twf celloedd mewn arbrofion |
| ② | siRNA rheolaeth negyddol (dilyniant siRNA amhenodol) | Dangos pa mor benodol yw gweithred RNAi.gall siRNA ysgogi ymateb straen amhenodol ar grynodiad o 200nM. |
| ③ | Rheoli Adweithydd Trawsnewid | Peidiwch â chynnwys gwenwyndra'r adweithydd trawsyrru i'r celloedd na'r effaith ar fynegiant y genyn targed |
| ④ | siRNA yn erbyn genyn targed | Curwch fynegiant y genyn targed |
| ⑤ (dewisol) | siRNA positif | Fe'i defnyddir i ddatrys problemau system arbrofol a gweithredol |
| ⑥ (dewisol) | SiRNA rheoli fflwroleuol | Gellir arsylwi effeithlonrwydd trawsgludiad celloedd gyda microsgop |
2.2 Egwyddorion dylunio paent preimio
| Maint darn chwyddedig | Yn ddelfrydol ar 100-150bp |
| Hyd Primer | 18-25bp |
| Cynnwys GC | 30% -70%, yn ddelfrydol 45% -55% |
| Tm gwerth | 58-60 ℃ |
| Dilyniant | Osgoi T / C yn barhaus;A/G parhaus |
| 3 dilyniant diwedd | Osgoi GC cyfoethog neu AT gyfoethog;y sylfaen derfynell yn ddelfrydol G neu C;mae'n well osgoi T |
| Cyfatebolrwydd | Osgowch ddilyniannau cyflenwol o fwy na 3 sylfaen o fewn y paent preimio neu rhwng dau primer |
| Penodoldeb | Defnyddiwch chwiliad chwyth i gadarnhau penodoldeb preimiwr |
Mae ①SiRNA yn rhywogaeth-benodol, a bydd dilyniannau gwahanol rywogaethau yn wahanol.
Mae ②SiRNA wedi'i becynnu mewn powdr rhewi-sych, y gellir ei storio'n sefydlog am 2-4 wythnos ar dymheredd yr ystafell.
2.3 Offer neu adweithyddion y mae angen eu paratoi ymlaen llaw
| Primer (cyfeiriad mewnol) | Gan gynnwys blaen a chefn dau |
| preimio (genyn targed) | Gan gynnwys blaen a chefn dau |
| Targed Si RNA (3 stribed) | Yn gyffredinol, bydd y cwmni'n syntheseiddio 3 stribed, ac yna'n dewis un o'r tri gan RT-PCR |
| Cit Trawsnewid | Lipo2000 ac ati. |
| Pecyn Echdynnu Cyflym RNA | Ar gyfer echdynnu RNA ar ôl transfection |
| Pecyn Trawsgrifio Gwrthdroi Cyflym | ar gyfer synthesis cDNA |
| Pecyn Ymhelaethu PCR | 2 × Gwyrdd SYBR Super qPCR Cymysgedd Meistr |
2.4 O ran y materion y mae angen rhoi sylw iddynt yn y camau arbrofol penodol:
①siRNA broses transfection
1. Ar gyfer platio, gallwch ddewis plât 24-ffynnon, plât 12-ffynnon neu blât 6-ffynnon (mae'r crynodiad RNA cyfartalog a gynigir ym mhob ffynnon o blât 24-ffynnon tua 100-300 ng/uL), ac mae'r dwysedd trawsyrru celloedd gorau posibl hyd at 60% -80% neu fwy.
2. Mae'r camau transfection a gofynion penodol yn gwbl unol â'r cyfarwyddiadau.
3. Ar ôl transfection, gellir casglu samplau o fewn 24-72 awr ar gyfer canfod mRNA (RT-PCR) neu ganfod protein o fewn 48-96 awr (WB)
② proses echdynnu RNA
1. Atal halogiad gan ensymau alldarddol.Mae'n bennaf yn cynnwys gwisgo masgiau a menig yn llym;defnyddio blaenau pibed wedi'u sterileiddio a thiwbiau EP;rhaid i'r dŵr a ddefnyddir yn yr arbrawf fod yn rhydd o RNase.
2. Argymhellir gwneud ddwywaith fel yr awgrymir yn y pecyn echdynnu cyflym, a fydd yn wir yn gwella'r purdeb a'r cynnyrch.
3. Rhaid i'r hylif gwastraff beidio â chyffwrdd â'r golofn RNA.
③ meintioli RNA
Ar ôl i'r RNA gael ei dynnu, gellir ei feintioli'n uniongyrchol â Nanodrop, a gall y darlleniad lleiaf fod mor isel â 10ng/ul.
④ Proses trawsgrifio gwrthdroi
1. Oherwydd sensitifrwydd uchel RT-qPCR, dylid gwneud o leiaf 3 ffynnon gyfochrog ar gyfer pob sampl i atal y Ct dilynol rhag bod yn rhy wahanol neu'r SD i fod yn rhy fawr ar gyfer dadansoddiad ystadegol.
2. Peidiwch â rhewi a dadmer Meistr cymysgedd dro ar ôl tro.
3. Rhaid gosod tip newydd yn lle pob tiwb/twll!Peidiwch â defnyddio'r un blaen pibed yn barhaus i ychwanegu samplau!
4. Mae angen llyfnu'r ffilm sydd ynghlwm wrth y plât 96-ffynnon ar ôl ychwanegu'r sampl gyda phlât.Mae'n well centrifuge cyn ei roi ar y peiriant, fel y gall yr hylif ar wal y tiwb lifo i lawr a chael gwared ar swigod aer.
⑤ Dadansoddiad cromlin cyffredin
| Dim cyfnod o dwf logarithmig | Crynodiad uchel o bosibl o dempled |
| Dim gwerth CT | Camau anghywir ar gyfer canfod signalau fflwroleuol; diraddio preimwyr neu stilwyr - gellir canfod ei gyfanrwydd trwy electrofforesis TUDALEN; swm annigonol o dempled; diraddio templedi – osgoi cyflwyno amhureddau a rhewi a dadmer dro ar ôl tro wrth baratoi samplau; |
| Ct>38 | Effeithlonrwydd ymhelaethu isel;Mae cynnyrch PCR yn rhy hir;mae gwahanol gydrannau adwaith yn cael eu diraddio |
| Cromlin ymhelaethu llinellol | Gall stilwyr gael eu diraddio'n rhannol trwy gylchredau rhewi-dadmer dro ar ôl tro neu amlygiad hirfaith i olau |
| Mae'r gwahaniaeth mewn tyllau dyblyg yn arbennig o fawr | Nid yw'r hydoddiant adwaith wedi'i doddi'n llwyr neu nid yw'r ateb adwaith yn gymysg;mae bath thermol yr offeryn PCR wedi'i halogi gan sylweddau fflwroleuol |
2.5 Ynghylch dadansoddi data
Gellir rhannu dadansoddiad data qPCR yn feintoli cymharol a meintioli absoliwt.Er enghraifft, celloedd yn y grŵp triniaeth o'u cymharu â chelloedd yn y grŵp rheoli,
Sawl gwaith y mae mRNA y genyn X yn newid, meintioliad cymharol yw hwn;mewn nifer penodol o gelloedd, mRNA y genyn X
Faint o gopïau sydd, mae hyn yn fesuriad absoliwt.Fel arfer, yr hyn rydyn ni'n ei ddefnyddio fwyaf yn y labordy yw'r dull meintiol cymharol.Fel arfer,y dull 2-ΔΔctyn cael ei ddefnyddio fwyaf mewn arbrofion , felly dim ond y dull hwn a gyflwynir yn fanwl yma.
Dull 2-ΔΔct: Y canlyniad a gafwyd yw'r gwahaniaeth yn y mynegiant y genyn targed yn y grŵp arbrofol o'i gymharu â'r genyn targed yn y grŵp rheoli.Mae'n ofynnol bod effeithlonrwydd chwyddo'r genyn targed a'r genyn cyfeirio mewnol yn agos at 100%, ac ni ddylai'r gwyriad cymharol fod yn fwy na 5%.
Mae'r dull cyfrifo fel a ganlyn:
Grŵp rheoli Δct = gwerth ct y genyn targed yn y grŵp rheoli – gwerth ct y genyn cyfeirio mewnol yn y grŵp rheoli
Δct grŵp arbrofol = gwerth ct y genyn targed yn y grŵp arbrofol – gwerth ct y genyn cyfeirio mewnol yn y grŵp arbrofol
ΔΔct=Δct grŵp rheoli arbrofol-Δct
Yn olaf, cyfrifwch y lluosrif o wahaniaeth yn lefel mynegiant:
Newid Plygiad = 2-ΔΔct (sy'n cyfateb i'r ffwythiant excel yw POWER)
Cynhyrchion cysylltiedig:
Pecyn Cell Uniongyrchol RT-qPCR
Amser postio: Mai-20-2023
