Mae PCR Amser Real, a elwir hefyd yn PCR meintiol neu qPCR, yn ddull ar gyfer monitro amser real a dadansoddi cynhyrchion ymhelaethu PCR.
Oherwydd bod gan PCR meintiol fanteision gweithrediad syml, cyflym a chyfleus, sensitifrwydd uchel, ailadroddadwyedd da, a chyfradd halogi isel, fe'i defnyddir yn eang mewn profion meddygol, asesu effeithiolrwydd cyffuriau, ymchwil mynegiant genynnau, ymchwil trawsgenig, canfod genynnau, canfod pathogenau, canfod anifeiliaid a phlanhigion., profi bwyd a meysydd eraill.
Felly, p'un a ydych chi'n cymryd rhan mewn ymchwil sylfaenol ym maes gwyddorau bywyd, neu'n gyflogeion i gwmnïau fferyllol, cwmnïau hwsmonaeth anifeiliaid, cwmnïau bwyd, neu hyd yn oed weithwyr archwilio mynediad-ymadael a swyddfeydd cwarantîn, adrannau monitro amgylcheddol, ysbytai ac unedau eraill, byddwch yn fwy neu lai yn agored i Neu mae angen i chi wybod y wybodaeth am feistroli PCR meintiol.

Egwyddor PCR Amser Real

Mae PCR Amser Real yn ddull lle mae sylweddau fflwroleuol yn cael eu hychwanegu at y system adwaith PCR, ac mae dwyster signal fflworoleuedd yn y broses o adwaith PCR yn cael ei fonitro mewn amser real gan offeryn PCR meintiol, ac yn olaf mae'r data arbrofol yn cael ei ddadansoddi a'i brosesu.

【Cromlin ymhelaethu】yw'r gromlin sy'n disgrifio proses ddeinamig PCR.Nid cromlin esbonyddol safonol yw cromlin ymhelaethu PCR mewn gwirionedd, ond cromlin sigmoid.

[Cam llwyfan y gromlin ymhelaethu]Gyda'r cynnydd yn nifer y cylchoedd PCR, anactifadu DNA polymeras, disbyddu dNTPs a paent preimio, ac ataliad yr adwaith synthesis gan y pyrophosphate sgil-gynnyrch adwaith, ac ati, nid yw'r PCR bob amser yn ehangu'n esbonyddol., a bydd yn y pen draw yn mynd i mewn i lwyfandir.

[Rhanbarth Twf Esbonyddol Cromlin Ymhelaethiad]Er bod cyfnod y llwyfandir yn amrywio'n fawr, mewn rhanbarth penodol o ranbarth twf esbonyddol y gromlin ymhelaethu, mae'r ailadroddadwyedd yn dda iawn, sy'n bwysig iawn ar gyfer dadansoddiad meintiol o PCR.

[Gwerth trothwy a gwerth Ct]Rydym yn gosod gwerth terfyn canfod fflworoleuedd ar y safle priodol yn ardal twf esbonyddol y gromlin ymhelaethu, sef y gwerth trothwy (Trothwy).Croestoriad y gwerth trothwy a'r gromlin ymhelaethu yw'r gwerth Ct, hynny yw, mae'r gwerth Ct yn cyfeirio at nifer y cylchoedd (Cylch Trothwy) pan gyrhaeddir y gwerth trothwy.

Mae'r graff isod yn dangos yn glir y berthynas rhwng llinell drothwy a chromlin chwyddo, trothwy a gwerth Ct.

【Sut i feintioli?】

Mae damcaniaeth fathemategol wedi'i phrofi bod gan y gwerth Ct berthynas llinol wrthdro â logarithm nifer y templedi cychwynnol.Mae PCR Amser Real yn monitro cynhyrchion ymhelaethu PCR mewn amser real ac yn eu mesur yn ystod y cyfnod ymhelaethu esbonyddol.

Ar gyfer pob cylch o PCR, cynyddodd y DNA yn esbonyddol 2 waith, a chyrhaeddodd lwyfandir yn fuan.

Gan dybio mai maint y DNA cychwynnol yw A₀ , ar ôl n cylchoedd, gellir mynegi swm damcaniaethol y cynnyrch DNA fel:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Yna, po fwyaf yw'r swm DNA cychwynnol A 0, y cynharaf y bydd swm y cynnyrch chwyddedig yn cyrraedd y gwerth canfod An , a nifer y cylchoedd wrth gyrraedd An yw'r gwerth Ct.Hynny yw, po fwyaf yw'r swm DNA cychwynnol A 0, y cynharaf y mae'r gromlin ymhelaethu yn cyrraedd uchafbwynt, a'r cyfatebol yw'r nifer gofynnol o gylchoedd n yn llai.

Rydym yn gwanhau graddiant safon y crynodiad hysbys ac yn ei ddefnyddio fel templed ar gyfer PCR Amser Real, a cheir cyfres o gromliniau ymhelaethu ar gyfnodau cyfartal yn nhrefn cychwyn swm DNA o fwy i lai.Yn ôl y berthynas linellol rhwng y gwerth Ct a logarithm nifer y templedi cychwynnol, agellir creu [cromlin safonol] .

Trwy amnewid gwerth Ct y sampl â chrynodiad anhysbys i'r gromlin safonol, gellir cael swm templed cychwynnol y sampl â chrynodiad anhysbys, sef egwyddor feintiol PCR Amser Real.

Dull canfod PCR Amser Real

Mae PCR Amser Real yn canfod cynhyrchion ymhelaethu PCR trwy ganfod dwyster fflworoleuedd yn y system adwaith.

Egwyddor Dull Mewnosod Lliw Fflworoleuol】

llifynnau fflwroleuol, fel TB Green ® , yn gallu rhwymo'n amhenodol i DNA llinyn dwbl mewn systemau PCR a fflworoleuedd wrth rwymo.

Cynyddodd dwyster fflworoleuedd yn y system adwaith yn esbonyddol gyda chynnydd mewn cylchoedd PCR.Trwy ganfod y dwyster fflworoleuedd, gellir monitro faint o ymhelaethu DNA yn y system adwaith mewn amser real, ac yna gellir amcangyfrif swm y templed cychwynnol yn y sampl yn wrthdro.

【Egwyddor dull stiliwr fflwroleuol】

chwiliwr fflwroleuolyn ddilyniant asid niwclëig gyda grŵp fflwroleuol ar y pen 5′ a grŵp diffodd ar y pen 3′, sy'n gallu clymu'n benodol i'r templed.Pan fydd y stiliwr yn gyfan, mae'r fflworoleuedd a allyrrir gan y fflworoffor yn cael ei ddiffodd gan y grŵp diffodd ac ni all fflworoleuedd.Pan fydd y stiliwr yn cael ei ddadelfennu, bydd y sylwedd fflwroleuol yn daduno ac yn allyrru fflworoleuedd.

Mae stiliwr fflwroleuol yn cael ei ychwanegu at yr ateb adwaith PCR.Yn ystod y broses anelio, bydd y stiliwr fflwroleuol yn rhwymo i safle penodol y templed.Yn ystod y broses ymestyn, gall gweithgaredd exonuclease 5′→3′ yr ensym PCR ddadelfennu'r chwiliwr fflwroleuol wedi'i groesi â'r templed, ac mae'r sylwedd fflwroleuol wedi'i ddatgysylltu i allyrru fflworoleuedd.Trwy ganfod dwyster fflworoleuedd y stiliwr yn y system adwaith, gellir cyflawni pwrpas monitro maint ymhelaethu ar y cynnyrch PCR.

【Dethol Dull Canfod Fflworoleuedd】

Os caiff ei ddefnyddio i wahaniaethu rhwng dilyniannau â homoleg uchel a pherfformio canfod PCR amlblecs fel dadansoddiad teipio PCE, mae'r dull stiliwr fflwroleuol yn anadferadwy.
Ar gyfer arbrofion PCR Amser Real eraill, gellir defnyddio dull chimera fflwroleuol syml, hawdd a chost isel.

chwiliwr Penodoldeb cryf, gallu amlblecs PCR

Diffyg

Gofynion penodoldeb uchel ar gyfer ymhelaethu;

ni ellir cyflawni PCR amlblecsAngen dylunio stilwyr penodol, cost uchel;

weithiau mae dylunio stiliwr yn anodd

Cynhyrchion Cysylltiedig: