Penodoldeb canfod

Yn y rhan fwyaf o achosion, pwrpas dyluniad paent preimio yw gwneud y mwyaf o benodolrwydd PCR.Mae hyn yn cael ei bennu gan ddylanwad mwy neu lai rhagweladwy llawer o newidynnau.Un newidyn pwysig yw'r dilyniant ar ben 3′y preimiwr.

Yn bwysig, mae profion PCR a gynlluniwyd ar gyfer penodoldeb yn fwy tebygol o gynnal effeithlonrwydd uchel dros ystod ddeinamig eang, oherwydd nid yw'r assay yn cynhyrchu cynhyrchion ymhelaethu amhenodol, a thrwy hynny gystadlu ag adweithyddion PCR neu atal y prif adwaith mwyhau.

Wrth gwrs, mewn rhai achosion, nid penodoldeb yw'r pwysicaf, er enghraifft, pan mai'r nod yw meintioli pathogenau sy'n perthyn yn agos ond gwahanol, mae angen safonau dylunio, optimeiddio a gwirio arbennig.

Mae'r gromlin doddi yn ddull safonol ar gyfer asesu penodoldeb amplicons, o leiaf o ran a ddylid ymhelaethu ar un targed.Fodd bynnag, rhaid pwysleisio y gall y cromliniau toddi fod yn gamarweiniol oherwydd, er enghraifft, gallant gael eu heffeithio gan effeithiau cyfunol paent preimio is-optimaidd a chrynodiadau templed isel.

P5 |Mae'r gromlin doddi yn dangos y sifftiau Tm a gafwyd o ddau ganfodiad o wahanol symiau o ddau DNA targed.

A. Mewn crynodiadau uwch (ad)), nid oes dimer primer amlwg ar ôl i'r mesuriad qPCR gael ei gwblhau.Wrth i grynodiad y templed ostwng i 50 copi (e), mae cynnyrch amhenodol yn dechrau ymddangos a dyma'r unig gynnyrch â'r crynodiad isaf (f).

B. Cofnododd y prawf yr un Tms ym mhob crynodiad targed, ac nid oedd dimer paent preimio amlwg hyd yn oed ar y crynodiad isaf (5 copi).Wrth ddefnyddio'r ddau ddull canfod hyn, ni chanfuwyd unrhyw gynhyrchion ymhelaethu mewn NTCs.

Mae Ll5 yn dangos y cromliniau hydoddi a gafwyd gyda samplau lle mae'r templed yn bresennol mewn crynodiadau gwahanol.Mae P 5a yn dangos, yn y ddau grynodiad isaf, bod Tms y cynhyrchion mwyhau amhenodol a gynhyrchir yn is na rhai'r amplicons penodol.

Yn amlwg, ni ellir defnyddio'r dull canfod hwn yn ddibynadwy i ganfod targedau sy'n bodoli mewn crynodiadau isel.

Yn ddiddorol, ni chofnododd NTCs, hy, samplau heb unrhyw DNA o gwbl, gynhyrchion ymhelaethu (amhenodol), gan nodi y gall DNA genomig cefndirol gymryd rhan mewn ymhelaethu / polymerization amhenodol.

Weithiau ni ellir cywiro paent preimio cefndir o'r fath ac ymhelaethu amhenodol, ond yn aml mae'n bosibl dylunio dull canfod nad oes ganddo ymhelaethiad amhenodol mewn unrhyw grynodiad templed ac NTC (P 5b).

Yma, bydd hyd yn oed cofnodi ymhelaethu ar y crynodiad targed gyda Cq o 35 yn cynhyrchu cromlin hydoddi benodol.Yn yr un modd, nid oedd NTCs yn dangos unrhyw arwyddion o ymhelaethu amhenodol.Weithiau, gall yr ymddygiad canfod fod yn ddibynnol ar y fam ddiodydd, a dim ond ymhelaethiad amhenodol a ganfyddir mewn rhai cyfansoddiadau byffer, a all fod yn gysylltiedig â chrynodiadau Mg2+ gwahanol.

Sefydlogrwydd canfod

Mae optimeiddio Ta yn gam defnyddiol yn y broses ddilysu ac optimeiddio empirig o ganfod qPCR.Mae'n rhoi arwydd uniongyrchol o gadernid y set preimio trwy ddangos y tymheredd (neu'r ystod tymheredd) sy'n cynhyrchu'r Cq isaf heb ymhelaethu ar yr NTC.

Efallai na fydd y gwahaniaeth dwy i bedair gwaith mewn sensitifrwydd yn bwysig i bobl â mynegiant mRNA uchel, ond ar gyfer profion diagnostig, gall olygu'r gwahaniaeth rhwng canlyniadau negyddol cadarnhaol a ffug.

Gall priodweddau Ta paent preimio qPCR amrywio'n fawr.Nid yw rhai profion yn gadarn iawn, ac os na chânt eu perfformio o dan y gwerth Ta gorau posibl o'r paent preimio, byddant yn cwympo'n gyflym.

Mae hyn yn bwysig oherwydd bod y math hwn o ganfod yn aml yn broblematig yn y byd go iawn, ac efallai nad yw purdeb y sampl, crynodiad DNA, neu bresenoldeb DNA arall yn optimaidd.

Yn ogystal, gall nifer y copi targed amrywio mewn ystod eang, a gall yr adweithyddion, offer plastig, neu offerynnau fod yn wahanol i'r rhai a ddefnyddir wrth sefydlu'r prawf.

P6| Mae'r graddiant tymheredd yn dangos cadernid gwahanol canfod PCR.

A. Defnyddiwch Mastermix Sensifast SYBR Bioline (rhif catalog BIO-98050) i berfformio PCR ar cDNA a baratowyd o RNA ymennydd dynol.

B. Defnyddiwch offeryn CFX qPCR Bio-Rad i gofnodi'r map ymhelaethu a chromlin diddymu apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. Graff ymhelaethu a chromlin doddi ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. Graff ymhelaethu a chromlin diddymu GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs wedi'u cofnodi ar wahanol dymereddau anelio, sy'n dangos y gwahaniaeth mewn Cq a gofnodwyd o dan raddiant tymheredd 7C.

Mae P 6 yn dangos canlyniad nodweddiadol prawf annymunol, lle perfformiwyd qPCR gan ddefnyddio graddiant Tas rhwng 59C a 67C (P 6a), gan ddefnyddio paent preimio ar gyfer tri genyn ymennydd-benodol dynol.

Gellir gweld o'r graff ymhelaethu bod paent preimio Opalin ymhell o fod yn ddelfrydol oherwydd bod eu hystod Ta optimaidd yn gul iawn (Ffigur 6b), hynny yw, mae Cqs wedi'u gwasgaru'n eang, gan arwain at gymharu Cqs yn sylweddol â'u Cqs Isel gorau posibl.

Mae'r dull canfod hwn yn ansefydlog a gall arwain at ymhelaethu is-optimaidd.Felly, dylid ailgynllunio'r pâr hwn o breimwyr.Yn ogystal, mae'r dadansoddiad cromlin toddi (mewnosodiad) yn dangos y gallai penodoldeb y dull canfod hwn fod yn broblemus hefyd, oherwydd bod cromlin toddi pob Ta yn wahanol.

Mae'r dull canfod ACSBG1 a ddangosir yn P 6c yn fwy cadarn na'r dull canfod Opalin uchod, ond mae'n dal i fod ymhell o fod yn ddelfrydol, ac mae'n debygol y gellir ei wella.

Fodd bynnag, pwysleisiwn nad oes unrhyw gysylltiad angenrheidiol rhwng cadernid a phenodoldeb, oherwydd bod y gromlin ddiddymu a gynhyrchir gan y dull canfod hwn yn dangos yr un gwerth brig ym mhob Tas (mewnosodiad).

Ar y llaw arall, mae'r prawf cadernid yn llawer mwy goddefgar, gan gynhyrchu Cqs tebyg mewn ystod eang o Tas, fel yn y prawf GFAP a ddangosir yn P 6d.

Mae'r gwahaniaeth mewn Cqs a gafwyd yn yr un ystod 8 gradd Celsius yn llai nag 1, ac mae'r gromlin diddymu (mewnosod) yn cadarnhau'r nodweddion canfod yn yr ystod tymheredd hwn.Mae'n werth nodi y gall y TAS a gyfrifwyd a'r amrediad Ta gwirioneddol fod yn wahanol iawn.

Mae yna lawer o ganllawiau wedi'u cynllunio i helpu ymchwilwyr i ddylunio paent preimio effeithlon, y rhan fwyaf ohonynt yn seiliedig ar reolau hirsefydlog ac mae llawer o sylw wedi'i roi i 3′diwedd y paent preimio.Yn aml, argymhellir cynnwys G neu C ar y pen 3' a dau waelod G neu C (clamp GC), ond dim mwy na dau o'r 5 gwaelod olaf.

Yn ymarferol, gall y rheolau hyn arwain ymchwilwyr, ond nid ydynt o reidrwydd yn gywir o dan bob amgylchiad.

P7 |Nid yw pen 3′ y paent preimio yn cael fawr o effaith ar benodolrwydd nac effeithlonrwydd.

A. Lleoliad y paent preimio ar gyfer y genyn dynol HIF-1α (NM_181054.2).

B. Defnyddiwch Agilent Brilliant III SYBR Gwirod mam gwyrdd (Cat. Rhif 600882) i ymhelaethu ar chwe eitem prawf.

C. Graff ymhelaethu a chromlin doddi a gofnodwyd gan offeryn QPCR CFX Bio-Rad a phaent preimio 3′diwedd.Dangosir NTCs mewn coch.

D. Cofnod Cqs o bob eitem prawf

Er enghraifft, mae canlyniad P 7 yn gwrth-ddweud y rheol 3′diwedd.Mae pob dyluniad yn cynhyrchu'r un canlyniadau yn y bôn, gyda dim ond dau gyfuniad paent preimio yn arwain at ymhelaethu amhenodol yn NTC.

Fodd bynnag, ni allwn gefnogi effaith y clip GC, oherwydd yn yr achos hwn, nid yw defnyddio A neu T fel uchafswm o 30 sylfaen yn lleihau penodoldeb.

Cofnododd Prawf C, lle mae'r preimiwr F yn gorffen yn GGCC, Cqs mewn NTCs, gan nodi y gallai rhywun fod eisiau osgoi'r dilyniannau hyn ar y 30-diwedd.Pwysleisiwn mai'r unig ffordd o bennu'r dilyniant 3′diwedd gorau o bâr preimio yw gwerthuso rhai ymgeiswyr preimio yn arbrofol.

Effeithlonrwydd ymhelaethu

Yn bwysig, er na all canfod PCR amhenodol byth ddod yn benodol, gellir addasu'r effeithlonrwydd ymhelaethu a'i gynyddu i'r eithaf mewn llawer o wahanol ffyrdd trwy newid yr ensym, gwirod mam, ychwanegion, ac amodau beicio.

Er mwyn gwerthuso effeithlonrwydd canfod PCR, mae'n well defnyddio gwanhad cyfresol o 10 neu 5 gwaith yr asid niwclëig targed, hynny yw, y “dull cromlin safonol”.

Os defnyddir amplicons PCR neu dargedau DNA synthetig i gynhyrchu cromlin safonol, dylid cymysgu gwanediadau cyfresol o'r targedau hyn â swm cyson o DNA cefndir (fel DNA genomig).

P8 |Cromlin wanhau i werthuso effeithlonrwydd PCR.

A. Defnyddio paent preimio ar gyfer HIF-1: F: AAGAACTTTT CSSGCTCA a R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ac Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (rhif catalog 600882) ar gyfer PCR ac amodau cromlin toddi.

Cafodd B. 100 ng RNA ei drawsgrifio o'r neilltu, ei wanhau 2 waith, a chafodd samplau cDNA wedi'u gwanhau'n gyfresol eu gwanhau 5 gwaith i 1 ng DNA genomig dynol.Dangosir y gromlin doddi yn y mewnosodiad.

C. Ailadroddwyd yr adwaith RT, gwanhau, a gwanhau cyfresol ar gyfer yr ail sampl cDNA, ac roedd y canlyniadau'n debyg.

Mae P 8 yn dangos dwy gromlin safonol, gan ddefnyddio'r un dull canfod ar ddau sampl cDNA gwahanol, y canlyniad yw'r un effeithlonrwydd, tua 100%, ac mae'r gwerth R2 hefyd yn debyg, hynny yw, maint y ffit rhwng y data arbrofol a'r llinell atchweliad neu'r data Gradd llinoledd.

Mae'r ddwy gromlin safonol yn gymaradwy, ond nid yn union yr un peth.Os mai’r pwrpas yw meintioli’r targed yn gywir, rhaid nodi ei bod yn annerbyniol darparu cyfrifiad rhif copi heb egluro’r ansicrwydd.

P9 |Ansicrwydd mesur sy'n gysylltiedig â meintioli gan ddefnyddio cromlin safonol.

A. Defnyddio paent preimio ar gyfer GAPDH (NM_002046) i berfformio PCR a chromlin toddi amodau.F: ACAGTTGCCTGTAGACC ac R: TAACTGGTTGAGCACAGG a Mastermix SYBR Sensifast Bioline (rhif catalog BIO-98050).

B. Siart ymhelaethu, cromlin toddi a chromlin safonol a gofnodwyd gydag offeryn QPCR CFX Bio-Rad.

C. Graff cromlin safonol a chyfwng hyder 95% (CI).

D. Rhif copi a chyfwng hyder 95% y tri gwerth Cq sy'n deillio o'r gromlin wanhau.

Mae P 9 yn dangos, ar gyfer prawf wedi'i optimeiddio, bod amrywioldeb cynhenid ​​cromlin safonol sengl oddeutu 2 waith (cyfwng hyder 95%, lleiafswm i uchafswm), a all fod yr amrywioldeb lleiaf y gellir ei ddisgwyl.

Cynnyrch cysylltiedig:

Cell Uniongyrchol RT qPCR Kit

Pecyn PCR Uniongyrchol Cynffon Llygoden

Pecyn PCR Uniongyrchol Meinwe Anifeiliaid