Datblygir RT-qPCR o dechnoleg PCR arferol.Mae'n ychwanegu cemegau fflwroleuol (lynnau fflwroleuol neu stilwyr fflwroleuol) i'r system adwaith PCR traddodiadol, ac yn canfod y broses anelio ac ymestyn PCR mewn amser real yn ôl eu gwahanol fecanweithiau goleuo.Defnyddir newidiadau signal fflwroleuol yn y cyfrwng i gyfrifo faint o newid cynnyrch ym mhob cylchred o PCR.Ar hyn o bryd, y dulliau mwyaf cyffredin yw dull llifyn fflwroleuol a dull archwilio.

Dull lliwio fflwroleuol:
Nid yw rhai llifynnau fflwroleuol, megis SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ac ati, yn allyrru golau ar eu pen eu hunain, ond yn allyrru fflworoleuedd ar ôl eu rhwymo i rigol bach dsDNA.Felly, ar ddechrau'r adwaith PCR, ni all y peiriant ganfod y signal fflwroleuol.Pan fydd yr adwaith yn symud ymlaen i'r anelio-estyniad (dull dau gam) neu gam ymestyn (dull tri cham), mae'r llinynnau dwbl yn cael eu hagor ar yr adeg hon, a'r DNA polymeras newydd Yn ystod synthesis llinyn, mae moleciwlau fflwroleuol yn cael eu cyfuno yn y rhigol leiaf dsDNA ac yn allyrru fflworoleuedd.Wrth i nifer y cylchoedd PCR gynyddu, mae mwy a mwy o liwiau yn cyfuno â dsDNA, ac mae'r signal fflwroleuol hefyd yn cael ei wella'n barhaus.Cymerwch SYBR Green Ⅰ fel enghraifft.
Dull archwilio:
stiliwr Taqman yw'r chwiliwr hydrolysis a ddefnyddir amlaf.Mae grŵp fflwroleuol ar ben 5′ y stiliwr, fel arfer FAM.Mae'r stiliwr ei hun yn ddilyniant sy'n ategu'r genyn targed.Mae grŵp diffodd fflwroleuol ar ben 3′ y fflworoffor.Yn ôl yr egwyddor o drosglwyddo ynni cyseiniant fflworoleuedd (trosglwyddiad ynni cyseiniant Förster, FRET), pan fydd y grŵp fflworoleuol gohebydd (moleciwl fflworoleuol rhoddwr) a'r grŵp fflworoleuol quenching (derbynnydd moleciwl fflworoleuol) Pan fydd y sbectrwm excitation gorgyffwrdd a'r pellter yn agos iawn (7-10nm), gall y moleciwl rhoddwr fflworoleuol derbyn tra'n excitation y moleciwl fflworoleuol yn derbyn, y moleciwl fflworoleuol. yn gwanhau.Felly, ar ddechrau'r adwaith PCR, pan fydd y stiliwr yn rhydd ac yn gyfan yn y system, ni fydd y grŵp fflworoleuol gohebydd yn allyrru fflworoleuedd.Wrth anelio, mae'r paent preimio a'r stiliwr yn clymu i'r templed.Yn ystod y cam ymestyn, mae'r polymeras yn syntheseiddio cadwyni newydd yn barhaus.Mae gan DNA polymeras 5′-3′ actifedd exonuclease.Wrth gyrraedd y stiliwr, bydd y DNA polymeras yn hydroleiddio'r stiliwr o'r templed, yn gwahanu'r grŵp fflwroleuol adroddwr oddi wrth y grŵp fflwroleuol quencher, ac yn rhyddhau'r signal fflwroleuol.Gan fod perthynas un-i-un rhwng y stiliwr a'r templed, mae'r dull stiliwr yn well na'r dull lliwio o ran cywirdeb a sensitifrwydd y prawf.

Ffig 1 Egwyddor qRT-PCR

Dyluniad primer
Egwyddorion:

Dylai'r paent preimio gael ei ddylunio yn rhanbarth cadw'r gyfres asid niwclëig a dylent fod yn benodol.

Mae'n well defnyddio dilyniant cDNA, ac mae dilyniant mRNA hefyd yn dderbyniol.Os na, darganfyddwch ddyluniad rhanbarth cds y dilyniant DNA.
Hyd y cynnyrch meintiol fflwroleuol yw 80-150bp, yr hiraf yw 300bp, mae hyd y paent preimio yn gyffredinol rhwng 17-25 sylfaen, ac ni ddylai'r gwahaniaeth rhwng y paent preimio i fyny'r afon ac i lawr yr afon fod yn rhy fawr.

Mae'r cynnwys G+C rhwng 40% a 60%, a 45-55% yw'r gorau.
Mae'r gwerth TM rhwng 58-62 gradd.
Ceisiwch osgoi dimers paent preimio a hunan-dimers, (peidiwch ag edrych yn fwy na 4 pâr o seiliau cyflenwol yn olynol) strwythur hairpin, os na ellir ei osgoi, gwnewch ΔG <4.5kJ/mol* Os na allwch sicrhau bod gDNA wedi'i dynnu yn ystod trawsgrifio gwrthdro Glân, mae'n well dylunio paent preimio'r intron *3′/, ni ellir addasu'r pen draw i osgoi rhanbarthau cyfoethog, AT2/ A, ac ni ellir addasu'r strwythur ATC/ A (ATG2/Adeiledd diwedd A). -3) paent preimio a di-
penodol Mae homoleg y dilyniant heterogenely ymhelaethu yn ddelfrydol yn llai na 70% neu mae ganddo 8 homoleg sylfaen gyflenwol.
Cronfa ddata:
Chwilio CottonFGD yn ôl allweddeiriau
Dyluniad primer:
Dyluniad paent preimio IDT-qPCR

Tudalen offeryn dylunio paent preimio ar-lein Ffig2 IDT

Arddangos tudalen canlyniad Ffig3
Dyluniad paent preimio lncRNA:
lncRNA:yr un camau ag mRNA.
miRNA:Egwyddor y dull dolen coesyn: Gan fod pob miRNAs yn ddilyniannau byr o tua 23 nt, ni ellir canfod PCR yn uniongyrchol, felly defnyddir yr offeryn dilyniant dolen goesyn.Mae'r dilyniant dolen bonyn yn DNA un llinyn o tua 50 nt, sy'n gallu ffurfio strwythur pin gwallt ei hun.3 'Gellir dylunio'r diwedd fel dilyniant sy'n ategu'r darn rhannol miRNA, yna gellir cysylltu'r miRNA targed â'r dilyniant coesyn-dolen yn ystod trawsgrifio cefn, a gall y cyfanswm hyd gyrraedd 70bp, sy'n unol â hyd y cynnyrch chwyddedig a bennir gan qPCR.Cynffon miRNA dylunio paent preimio .
Canfod ymhelaethiad penodol:
Cronfa ddata chwyth ar-lein: CottonFGD chwyth yn ôl dilyniant tebygrwydd
Chwyth lleol: Cyfeiriwch at ddefnyddio Blast + i wneud chwyth lleol, gall linux a macos sefydlu cronfa ddata leol yn uniongyrchol, gellir gwneud system win10 hefyd ar ôl gosod bash ubuntu.Creu cronfa ddata chwyth lleol a chwyth lleol;agor ubuntu bash ar win10 .
Sylwch: Mae cotwm yr ucheldir a chotwm ynys y môr yn gnydau tetraploid, felly bydd canlyniad chwyth yn aml yn cyfateb i ddau neu fwy o bethau.Yn y gorffennol, mae defnyddio cds NAU fel cronfa ddata i berfformio chwyth yn debygol o ddod o hyd i ddau enyn homologaidd gyda dim ond ychydig o wahaniaethau SNP.Fel arfer, ni all y ddau genyn homologaidd gael eu gwahanu gan ddyluniad paent preimio, felly cânt eu trin fel yr un peth.Os oes indel amlwg, mae'r paent preimio fel arfer wedi'i ddylunio ar yr indel, ond gall hyn arwain at strwythur eilaidd y primer Mae'r ynni rhydd yn dod yn uwch, gan arwain at ostyngiad mewn effeithlonrwydd ymhelaethu, ond mae hyn yn anochel.

Canfod strwythur eilaidd paent preimio:
Camau:agor oligo 7 → dilyniant templed mewnbwn → cau is-ffenestr → arbed → lleoli paent preimio ar y templed, pwyswch ctrl+D i osod hyd paent preimio → dadansoddi strwythurau eilaidd amrywiol, megis corff hunan-dimerization, heterodimer, hairpin, diffyg cyfatebiaeth, ac ati Y ddau lun olaf yn Ffigur 4 yw canlyniadau profion y paent preimio.Mae canlyniad y paent preimio blaen yn dda, nid oes dimer amlwg a strwythur hairpin, dim seiliau cyflenwol parhaus, ac mae gwerth absoliwt ynni rhad ac am ddim yn llai na 4.5, tra bod y primer cefn yn dangos parhaus Mae'r 6 sylfaen yn gyflenwol, ac mae'r egni rhad ac am ddim yn 8.8;yn ogystal, mae dimer mwy difrifol yn ymddangos ar y pen 3′, ac mae pylu o 4 gwaelod yn olynol yn ymddangos.Er nad yw'r ynni rhydd yn uchel, gall y 3′ dimer Chl effeithio'n ddifrifol ar benodolrwydd ymhelaethu ac effeithlonrwydd ymhelaethu.Yn ogystal, mae angen gwirio am binnau gwallt, heterodimerau, a diffyg cyfatebiaeth.

Canlyniadau canfod oligo7 Ffig3
Canfod effeithlonrwydd ymhelaethu:
Mae effeithlonrwydd chwyddo'r adwaith PCR yn effeithio'n ddifrifol ar y canlyniadau PCR.Hefyd yn qRT-PCR, mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn arbennig o bwysig ar gyfer y canlyniadau meintiol.Cael gwared ar sylweddau, peiriannau a phrotocolau eraill yn y byffer adwaith.Mae ansawdd y paent preimio hefyd yn dylanwadu'n fawr ar effeithlonrwydd ymhelaethu qRT-PCR.Er mwyn sicrhau cywirdeb y canlyniadau, mae angen i'r meintioliad fflworoleuedd cymharol a'r meintioliad fflworoleuedd absoliwt ganfod effeithlonrwydd ymhelaethu ar y paent preimio.Cydnabyddir bod Effeithlonrwydd ymhelaethu qRT-PCR effeithiol rhwng 85% a 115%.Mae dau ddull:
1. Dull cromlin safonol:
a.Cymysgwch cDNA
b.Gwanhau graddiant
c.qPCR
d.Hafaliad atchweliad llinol i gyfrifo'r effeithlonrwydd ymhelaethu
2. LinRegPCR
Mae LinRegPCR yn rhaglen ar gyfer dadansoddi Data RT-PCR amser real, a elwir hefyd yn ddata PCR meintiol (qPCR) yn seiliedig ar SYBR Green neu gemeg debyg.Mae'r rhaglen yn defnyddio data nad yw'n llinell sylfaen wedi'i gywiro, yn perfformio cywiriad gwaelodlin ar bob sampl Ar wahân, yn pennu ffenestr llinoledd ac yna'n defnyddio dadansoddiad atchweliad llinol i ffitio llinell syth trwy'r set ddata PCR.O lethr y llinell hon cyfrifir effeithlonrwydd PCR pob sampl unigol.Defnyddir yr effeithlonrwydd PCR cymedrig fesul aplicon a'r gwerth Ct fesul sampl i gyfrifo crynodiad cychwynnol fesul sampl, wedi'i fynegi mewn unedau fflworoleuedd mympwyol.Mewnbynnu ac allbwn data trwy daenlen Excel.Sampl yn unig
mae angen cymysgu, dim graddiant
mae angen camau:(Cymerwch Bole CFX96 fel enghraifft, nid Peiriant gydag ABI clir)
arbrofi:mae'n arbrawf qPCR safonol.
Allbwn data qPCR:Gall LinRegPCR adnabod dau fath o ffeiliau allbwn: RDML neu ganlyniad Mwyhad meintiol.Mewn gwirionedd, dyma werth canfod amser real y rhif beicio a'r signal fflworoleuedd gan y peiriant, a cheir yr ymhelaethiad trwy ddadansoddi gwerth newid fflworoleuedd effeithlonrwydd y segment llinol.
Dewis data: Mewn theori, dylai'r gwerth RDML fod yn ddefnyddiadwy.Amcangyfrifir mai problem fy nghyfrifiadur yw na all y meddalwedd adnabod RDML, felly mae gennyf y gwerth allbwn excel fel y data gwreiddiol.Argymhellir perfformio sgrinio bras o'r data yn gyntaf, megis methiant ychwanegu samplau, ac ati Gellir dileu'r pwyntiau yn y data allbwn (wrth gwrs, ni allwch eu dileu, bydd LinRegPCR yn anwybyddu'r pwyntiau hyn yn y cam diweddarach)

Allforio data qPCR Ffig5

Ffig6 detholiad o samplau ymgeiswyr

Mewnbynnu data:Canlyniadau ehangu cymhwyster agored.xls, → agor LinRegPCR → ffeil → darllen o excel → dewis paramedrau fel y dangosir yn Ffigur 7 → Iawn → cliciwch pennu llinellau sylfaen

Ffig7 camau mewnbwn data linRegPCR

Canlyniad:Os nad oes ailadrodd, nid oes angen grwpio.Os oes ailadrodd, gellir golygu'r grŵp yn y grŵp sampl, a rhoi enw'r genyn yn y dynodwr, ac yna bydd yr un genyn yn cael ei grwpio'n awtomatig.Yn olaf, cliciwch ar y ffeil, allforio excel, a gweld y canlyniadau.Bydd effeithlonrwydd ymhelaethu a chanlyniadau R2 pob ffynnon yn cael eu harddangos.Yn ail, os rhannwch yn grwpiau, bydd yr effeithlonrwydd ymhelaethu cyfartalog wedi'i gywiro yn cael ei arddangos.Sicrhewch fod effeithlonrwydd ymhelaethu pob paent preimio rhwng 85% a 115%.Os yw'n rhy fawr neu'n rhy fach, mae'n golygu bod effeithlonrwydd ymhelaethu'r paent preimio yn wael.

Ffig 8 Canlyniad ac allbwn data

Proses arbrofol:
Gofynion ansawdd RNA:
Purdeb:1.7Mae 2.0 yn nodi y gall fod isothiocyanate gweddilliol.Dylai asid niwclëig glân A260/A230 fod tua 2 . Os oes amsugno cryf ar 230 nm, mae'n dangos bod cyfansoddion organig fel ïonau ffenadaidd.Yn ogystal, gellir ei ganfod gan electrofforesis gel agarose 1.5%.Pwyntiwch y marciwr, oherwydd nad oes gan y ssRNA unrhyw ddadnaturiad ac nid oes gan y logarithm pwysau moleciwlaidd berthynas llinol, ac ni ellir mynegi'r pwysau moleciwlaidd yn gywir.Canolbwyntio: Yn ddamcaniaetholddimllai na 100ng/ul, os yw'r crynodiad yn rhy isel, mae'r purdeb yn gyffredinol isel nid uchel

Ffig9 gel RNA

Yn ogystal, os yw'r sampl yn werthfawr a'r crynodiad RNA yn uchel, argymhellir ei ddiswyddo ar ôl echdynnu, a gwanhau'r RNA i grynodiad terfynol o 100-300ng/ul ar gyfer trawsgrifio gwrthdro.Yny broses o drawsgrifio o chwith, pan gaiff mRNA ei drawsgrifio, defnyddir paent preimio oligo (dt) sy'n gallu rhwymo'n benodol i gynffonau polyA ar gyfer trawsgrifio o chwith, tra bod lncRNA a circRNA yn defnyddio paent preimio hexamer ar hap (Ar hap 6 mer) ar gyfer trawsgrifio gwrthdro o gyfanswm RNA Ar gyfer miRNA, defnyddir preimwyr dolen gwddf-benodol miRNA ar gyfer trawsgrifiad gwrthdro.Mae llawer o gwmnïau bellach wedi lansio pecynnau cynffonnau arbennig.Ar gyfer y dull dolen coesyn, mae'r dull cynffon yn fwy cyfleus, trwybwn uchel, ac yn arbed adweithydd, ond ni ddylai effaith gwahaniaethu miRNAs o'r un teulu fod cystal â'r dull dolen goesyn.Mae gan bob pecyn trawsgrifio cefn ofynion ar gyfer crynodiad preimwyr genyn-benodol (dolenni coes).Y cyfeirnod mewnol a ddefnyddir ar gyfer miRNA yw U6.Yn y broses o wrthdroad coes-dolen, dylid gwrthdroi tiwb o U6 ar wahân, a dylid ychwanegu paent preimio blaen a chefn U6 yn uniongyrchol.Gall circRNA a lncRNA ddefnyddio HKGs fel cyfeiriad mewnol.Yncanfod cDNA,
os nad oes problem gydag RNA, dylai cDNA fod yn iawn hefyd.Fodd bynnag, os dilynir perffeithrwydd yr arbrawf, mae'n well defnyddio genyn cyfeirio mewnol (genyn cyfeirio, RG) a all wahaniaethu rhwng gDNA a cds.Yn gyffredinol, mae RG yn enyn cadw tŷ., HKG) fel y dangosir yn Ffigur 10;Bryd hynny, roeddwn yn gwneud protein storio ffa soia, a defnyddiais actin7 yn cynnwys intronau fel cyfeiriad mewnol.Maint y darn chwyddedig o'r paent preimio hwn mewn gDNA oedd 452bp, ac os defnyddiwyd cDNA fel templed, roedd yn 142bp.Yna canfu canlyniadau'r profion fod Rhan o'r cDNA mewn gwirionedd wedi'i halogi gan gDNA, a phrofodd hefyd nad oedd problem gyda chanlyniad trawsgrifio o chwith, a gellid ei ddefnyddio fel templed ar gyfer PCR.Mae'n ddiwerth rhedeg electrofforesis gel agarose yn uniongyrchol â cDNA, ac mae'n fand gwasgaredig, nad yw'n argyhoeddiadol.

Darganfod cDNA Ffig 10

Pennu amodau qPCRyn gyffredinol dim problem yn ôl protocol y pecyn, yn bennaf yn y cam o werth tm.Os nad yw rhai paent preimio wedi'u dylunio'n dda yn ystod dyluniad paent preimio, gan arwain at wahaniaeth mawr rhwng y gwerth tm a'r 60 ° C damcaniaethol, argymhellir bod y cDNA Ar ôl i'r samplau gael eu cymysgu, rhedeg PCR graddiant gyda phaent preimio, a cheisiwch osgoi gosod y tymheredd heb fandiau fel y gwerth TM.

Dadansoddi data

Mae'r dull prosesu PCR meintiol fflworoleuedd cymharol confensiynol yn y bôn yn ôl 2-ΔΔCT.Templed prosesu data.

Cynhyrchion Cysylltiedig:

Amser Real PCR Hawdd^TM – Taqman

Amser Real PCR Hawdd^TM -SYBR GWYRDD I

RT Easy I (Master Premix ar gyfer synthesis cDNA llinyn cyntaf)

RT Easy II (Master Premix ar gyfer synthesis cDNA llinyn cyntaf ar gyfer qPCR)