Sail dyluniad cysefin (gellir datrys problemau 99%)
1. Hyd primer: Mae angen 15-30bp ar y gwerslyfr, fel arfer tua 20bp.Mae'r cyflwr gwirioneddol yn well i fod yn 18-24bp i sicrhau'r penodoldeb, ond po hiraf y gorau, bydd primer rhy hir hefyd yn lleihau'r penodoldeb, ac yn lleihau'r cynnyrch.
2. Rhychwant ymhelaethu primer: mae 200-500bp yn briodol, a gellir ehangu'r darn i 10kb o dan amodau penodol.
3. Sylfaen Primer: Dylai cynnwys G+C fod yn 40-60%, nid yw rhy ychydig o effaith mwyhau G+C yn dda, mae gormod o G+C yn hawdd i ymddangos fel bandiau amhenodol.Mae'n well dosbarthu ATGC ar hap, gan osgoi clystyrau o fwy na 5 niwcleotidau purine neu pyrimidin.Aml-gc ar gyfer y dilyniannau diwedd 5′ a chanolradd i gynyddu sefydlogrwydd, osgoi GC cyfoethog ar y pen 3′, dim GC ar gyfer y 3 sylfaen olaf, neu dim GC ar gyfer 3 o'r 5 sylfaen olaf.
4. Osgoi strwythur eilaidd mewn paent preimio, ac osgoi ategu rhwng dau primers, yn enwedig ategu ar y diwedd 3 ', fel arall bydd dimer primer yn cael ei ffurfio a bydd bandiau mwyhau amhenodol yn cael eu cynhyrchu.
5. Dylid paru'r seiliau ar ddiwedd y paent preimio 3', yn enwedig y seiliau olaf a'r olaf ond un, yn llym er mwyn osgoi methiant PCR oherwydd seiliau terfynell heb eu paru.
6. Mae preimio wedi neu gellir eu hychwanegu gyda safleoedd holltiad priodol, ac yn ddelfrydol dylai'r dilyniant targed chwyddedig fod â safleoedd holltiad priodol, sy'n fuddiol iawn ar gyfer dadansoddi holltiad neu glonio moleciwlaidd.
7. Penodoldeb paent preimio: ni ddylai preimwyr fod â homoleg amlwg â dilyniannau eraill yn y gronfa ddata dilyniant asid niwclëig.
8. Dysgu sut i ddefnyddio meddalwedd: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Mae'r dyluniad ar-lein hwn yn gweithio orau).
Gall y cynnwys uchod ddatrys o leiaf 99% o broblemau dylunio paent preimio.
Rheoli manylion dyluniad paent preimio
1. hyd primer
Hyd paent preimio cyffredinol yw 18 ~ 30 sylfaen.Yn gyffredinol, y ffactor pwysicaf sy'n pennu tymheredd anelio'r paent preimio yw hyd y paent preimio.Yn gyffredinol, dewisir tymheredd anelio paent preimio (gwerth Tm -5 ℃), ac mae rhai yn defnyddio gwerth Tm yn uniongyrchol.Gellir defnyddio'r fformiwlâu canlynol i gyfrifo'n fras dymheredd anelio paent preimio.
Pan fo hyd y paent preimio yn llai na 20bp: [4(G + C) + 2 (A + T)] -5 ℃
Pan fydd hyd y paent preimio yn fwy na 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (% GC) -500 / hyd-5 ℃
Yn ogystal, gellir defnyddio llawer o feddalwedd hefyd i gyfrifo'r tymheredd anelio, bydd yr egwyddor gyfrifo yn wahanol, felly weithiau gall y gwerth cyfrifedig fod â bwlch bach.Er mwyn gwneud y gorau o adweithiau PCR, defnyddir y paent preimio byrraf sy'n sicrhau tymereddau anelio o ddim llai na 54 ℃ ar gyfer yr effeithlonrwydd a'r penodoldeb gorau.
Yn gyffredinol, mae penodolrwydd preimiwr yn cynyddu gan ffactor o bedwar ar gyfer pob niwcleotid ychwanegol, fel mai'r hyd preimio lleiaf ar gyfer y rhan fwyaf o gymwysiadau yw 18 niwcleotid.Nid yw terfyn uchaf hyd primer yn bwysig iawn, yn bennaf yn ymwneud ag effeithlonrwydd adwaith.Oherwydd entropi, yr hiraf yw'r paent preimio, yr isaf yw'r gyfradd y mae'n anelio i rwymo i'r DNA targed i ffurfio templed llinyn dwbl sefydlog i DNA polymeras ei rwymo.
Wrth ddefnyddio meddalwedd i ddylunio paent preimio, gellir pennu hyd y paent preimio gan werth TM yn ei dro, yn enwedig ar gyfer paent preimio PCR meintiol fflworoleuedd, dylid rheoli TM = 60 ℃ neu fwy.
2.GC cynnwys
Yn gyffredinol, mae cynnwys G+C mewn dilyniannau preimio yn 40% ~ 60%, a dylid cydgysylltu cynnwys GC a gwerth Tm pâr o breimwyr.Os oes gan y paent preimio A GC neu duedd AT difrifol, gellir ychwanegu swm priodol o gynffon A, T neu G a C i ben 5 'y primer.
3. tymheredd anelio
Dylai'r tymheredd anelio fod 5 ℃ yn is na'r tymheredd unchain.Os yw nifer y seiliau preimio yn fach, gellir cynyddu'r tymheredd anelio yn briodol, a all gynyddu penodoldeb PCR.Os yw nifer y gwaelodion yn fawr, gellir lleihau'r tymheredd anelio yn briodol.Ni fydd y gwahaniaeth tymheredd anelio rhwng pâr o preimwyr o 4 ℃ ~ 6 ℃ yn effeithio ar y cynnyrch PCR, ond yn ddelfrydol mae tymheredd anelio pâr o preimwyr yr un peth, a all amrywio rhwng 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Osgoi arwynebedd strwythur eilaidd y templed ymhelaethu
Mae'n well osgoi rhanbarth strwythur eilaidd y templed wrth ddewis y darn chwyddedig.Gellir rhagweld ac amcangyfrif strwythur eilaidd sefydlog y darn targed gan feddalwedd cyfrifiadurol perthnasol, sy'n ddefnyddiol ar gyfer dewis templedi.Mae canlyniadau arbrofol yn dangos bod yr ehangiad yn aml yn aflwyddiannus pan fo egni rhydd (△G) y rhanbarth i'w ehangu yn llai na 58.6lkJ/mol.
5. Diffyg cyfatebiaeth â DNA targed
Pan fydd y dilyniant DNA targed chwyddedig yn fawr, gall paent preimio glymu i rannau lluosog o'r DNA targed, gan arwain at fandiau lluosog yn ymddangos yn y canlyniad.Y tro hwn mae angen defnyddio gwefan profi meddalwedd BLAST:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Dewiswch Alinio dau ddilyniant (bl2seq).
Mae gludo dilyniannau preimio i barth 1 a dilyniannau DNA targed i barth 2 yn ymgyfnewidiol, ac mae BLAST yn cyfrifo posibiliadau cyflenwol, gwrth-synnwyr a phosibiliadau eraill, felly nid oes angen i ddefnyddwyr sylwi a yw'r ddwy gadwyn yn gadwyni synnwyr.Gallwch hefyd nodi'r rhif GI os ydych chi'n gwybod rhif GI y dilyniant yn y gronfa ddata, felly does dim rhaid i chi gludo rhan fawr o'r dilyniant.Yn olaf, cliciwch Alinio yn 3 i weld a oes gan y paent preimio sawl safle homologaidd yn y DNA targed.
6. terfynell primer
Pen 3' y paent preimio yw'r man lle mae'r estyniad yn dechrau, felly mae'n bwysig atal anghydweddu rhag dechrau yno.Ni ddylai diwedd 3 'fod yn fwy na 3 G neu C yn olynol, oherwydd bydd hyn yn achosi i'r paent preimio gael ei sbarduno ar gam yn rhanbarth dilyniant cyfoethogi G+C.Ni all y pen 3 'ffurfio unrhyw strwythur eilaidd, ac eithrio mewn adweithiau PCR (AS-PCR) arbennig, ni ellir anghydweddu diwedd 3′ y paent preimio.Er enghraifft, os caiff y rhanbarth amgodio ei chwyddo, ni ddylid terfynu'r 3 'diwedd primer yn nhrydydd safle codon, oherwydd bod trydydd safle codon yn dueddol o ddirywio, a fydd yn effeithio ar benodolrwydd ac effeithlonrwydd ymhelaethu.Wrth ddefnyddio paent preimio anecsio, cyfeiriwch at y tabl defnydd codon, rhowch sylw i ddewisiadau biolegol, peidiwch â defnyddio paent preimio anecsio ar y pen 3′, a defnyddiwch grynodiad uwch o breimwyr (1uM-3uM).
7. Strwythur eilaidd paent preimio
Ni ddylai'r paent preimio eu hunain fod â dilyniannau cyflenwol, fel arall bydd y paent preimio eu hunain yn plygu i mewn i strwythurau pin gwallt, a bydd y strwythur eilaidd hwn yn effeithio ar rwymo paent preimio a thempledi oherwydd rhwystr sterig.Os defnyddir crebwyll artiffisial, ni ddylai seiliau cyflenwol parhaus y paent preimio eu hunain fod yn fwy na 3bp.Ni ddylai fod unrhyw gyfatebiaeth rhwng y ddau primers, yn enwedig dylid osgoi gorgyffwrdd cyflenwol y diwedd 3 'er mwyn atal ffurfio dimers preimio.Yn gyffredinol, ni ddylai fod mwy na 4 sylfaen olynol homoleg neu gyfatebiaeth rhwng pâr o preimio.
8. Ychwanegu marcwyr neu loci
Ychydig iawn o effaith a gaiff y pen 5 ' ar benodolrwydd ymhelaethu ac felly gellir ei addasu heb effeithio ar benodolrwydd ymhelaethu.Roedd yr addasiad o primer 5 'diwedd yn cynnwys: ychwanegu safle cyfyngu ensymau;Biotin wedi'i labelu, fflworoleuedd, digocsin, Eu3+, ac ati. Cyflwyno dilyniannau DNA rhwymo protein;Cyflwyno safleoedd treiglo, mewnosod a cholli dilyniannau treiglo a chyflwyno dilyniannau hyrwyddwr, ac ati Bydd y seiliau ychwanegol yn effeithio fwy neu lai ar effeithlonrwydd ymhelaethu ac yn cynyddu'r siawns o ffurfio pylu paent preimio, ond rhaid gwneud rhai consesiynau ar gyfer y cam nesaf.Gellir ychwanegu dilyniannau ychwanegol nad ydynt yn bodoli ar y dilyniant targed, megis safleoedd cyfyngu a dilyniannau hyrwyddwr, at ben 5′ y paent preimio heb effeithio ar benodolrwydd.Nid yw'r dilyniannau hyn wedi'u cynnwys wrth gyfrifo gwerthoedd primer Tm, ond dylid eu profi am gyfatebiaeth a strwythur eilaidd mewnol.
9. Isglonau
Y rhan fwyaf o'r amser, dim ond clonio rhagarweiniol yw PCR, ac yna mae angen i ni is-glonio'r darn targed yn fectorau amrywiol, felly mae angen i ni ddylunio seiliau ychwanegol ar gyfer y llawdriniaeth nesaf yn y cam PCR.
Mae rhai dilyniannau a gynlluniwyd ar gyfer is-glonio wedi'u crynhoi isod.
Ychwanegwyd safle cyfyngiad endonuclease cyfyngiad
Ychwanegu safleoedd cyfyngu ensymau yw'r dull a ddefnyddir amlaf ar gyfer is-glonio cynhyrchion PCR.Yn gyffredinol, mae'r safle holltiad yn chwe sylfaen, yn ychwanegol at ddiwedd y safle holltiad 5 mae angen ychwanegu 2 ~ 3 sylfaen amddiffynnol.Fodd bynnag, mae nifer y seiliau amddiffynnol sy'n ofynnol gan wahanol ensymau yn wahanol.Er enghraifft, nid oes angen sylfaen amddiffynnol ar SalⅠ, mae angen 1 sylfaen amddiffynnol ar EcoRⅤ, mae angen 2 sylfaen amddiffynnol ar NotⅠ, ac mae angen 3 sylfaen amddiffynnol ar Hind Ⅲ.
Mae LIC yn ychwanegu'r gynffon
Enw llawn LIC yw clonio Ligation-Independent, dull clonio a ddyfeisiwyd gan Navogen yn benodol ar gyfer ei ran o'r fector pET.Mae gan y cludwr pET a baratowyd gan ddull LIC bennau gludiog llinyn sengl sylfaen 12-15 nad ydynt yn gyflenwol, sy'n ategu'r pennau gludiog cyfatebol ar y darn mewnosod targed.At ddibenion ymhelaethu, dylai dilyniant primer 5′ y darn a fewnosodwyd ategu'r fector LIC.Gall actifedd allanol 3′→5′ DNA polymeras T4 ffurfio pen gludiog un llinyn ar y darn a fewnosodwyd ar ôl amser byr.Oherwydd mai dim ond trwy anelio'r darn mewnosod parod a'r fector y gellir ffurfio'r cynnyrch ar y cyd, mae'r dull hwn yn gyflym ac yn effeithlon iawn, ac mae'n cael ei glonio dan gyfarwyddyd.
Cyfarwyddo clôn TA ychwanegu cynffon
Nid oedd clonio TA yn gallu targedu'r darn yn fector, felly yn ddiweddarach cyflwynodd Invitrogen fector a allai dargedu clonio, a oedd yn cynnwys pedwar sylfaen amlwg GTGGS ar un pen.Felly, wrth ddylunio paent preimio PCR, dylid ychwanegu dilyniannau cyflenwol yn unol â hynny, fel y gall darnau fod yn "gyfeiriedig".
Os ydych chi'n brin o amser, gallwch chi roi cynnig ar synthesis uniongyrchol, gan gyfuno'r genyn â'r fector, sef yr hyn rydyn ni'n ei alw'n synthesis genynnau ET mewn cyhyrwyr.
D. Dull clonio In-Fusion
Dim angen ligas, dim angen adwaith hir.Cyn belled â bod dilyniant ar ddau ben y fector llinol yn cael ei gyflwyno Wrth ddylunio paent preimio, yna mae'r cynnyrch PCR a'r fector llinol yn cael eu hychwanegu i'r toddiant ensymau mewn-fusion sy'n cynnwys BSA a'u gosod ar dymheredd yr ystafell am hanner awr, gellir perfformio'r trawsnewidiad.Mae'r dull hwn yn arbennig o addas ar gyfer trosi cyfaint mawr.
10. Cyfuno paent preimio
Weithiau, dim ond gwybodaeth ddilyniant gyfyngedig sy'n hysbys am ddyluniad paent preimio.Er enghraifft, os mai dim ond y dilyniant asid amino sy'n hysbys, gellir dylunio'r paent preimio uno.Mae paent preimio uno yn gymysgedd o ddilyniannau gwahanol sy'n cynrychioli'r holl bosibiliadau sylfaen gwahanol sy'n amgodio un asid amino.Er mwyn cynyddu penodoldeb, gallwch gyfeirio at y tabl defnydd codon i leihau annexation yn unol â dewisiadau defnydd sylfaenol gwahanol organebau.Gellir paru Hypoxanthine â'r holl waelodion i leihau tymheredd anelio'r paent preimio.Peidiwch â defnyddio'r seiliau sydd wedi'u hatodi ar ben 3′ y paent preimio oherwydd mae anelio'r 3 sylfaen olaf ar y pen 3′ yn ddigon i gychwyn PCR ar y safle anghywir.Defnyddir crynodiadau preimio uwch (1μM i 3μM) oherwydd nad yw paent preimio mewn llawer o gymysgeddau anecsio yn benodol i'r templed targed.
deunyddiau crai PCRrheolaeth
1. maint primer
Crynodiad pob paent preimio yw 0.1 ~ 1umol neu 10 ~ 100pmol.Mae'n well cynhyrchu'r canlyniad gofynnol gyda'r swm lleiaf o primer.Bydd crynodiad uchel o preimio yn achosi diffyg cyfatebiaeth ac ymhelaethu amhenodol, ac yn cynyddu'r siawns o ffurfio pylu rhwng paent preimio.
2. crynodiad primer
Mae crynodiad y paent preimio yn effeithio ar y penodoldeb.Mae'r crynodiad preimiwr gorau posibl yn gyffredinol rhwng 0.1 a 0.5μM.Mae crynodiadau paent preimio uwch yn arwain at fwyhau cynhyrchion amhenodol.
3. tymheredd anelio o preimio
Paramedr pwysig arall ar gyfer paent preimio yw'r tymheredd toddi (Tm).Dyma'r tymheredd pan fydd 50% o'r paent preimio a'r dilyniannau cyflenwol yn cael eu cynrychioli fel moleciwlau DNA llinyn dwbl.Mae'n ofynnol i Tm osod tymheredd anelio PCR.Yn ddelfrydol, mae'r tymheredd anelio yn ddigon isel i sicrhau anelio'r paent preimio yn effeithiol gyda'r dilyniant targed, ond yn ddigon uchel i leihau rhwymo amhenodol.Tymheredd anelio rhesymol o 55 ℃ i 70 ℃.Yn gyffredinol, mae tymheredd anelio wedi'i osod 5 ℃ yn is na Tm o preimio.
Mae yna nifer o fformiwlâu ar gyfer gosod Tm, sy'n amrywio'n fawr yn dibynnu ar y fformiwla a ddefnyddir a dilyniant y paent preimio.Gan fod y rhan fwyaf o fformiwlâu yn darparu amcangyfrif o werth Tm, dim ond man cychwyn yw pob tymheredd anelio.Gellir gwella penodoldeb trwy ddadansoddi sawl adwaith sy'n codi'r tymheredd anelio yn raddol.Dechreuwch o dan yr amcangyfrif Tm-5 ℃, a chynyddwch y tymheredd anelio yn raddol mewn cynyddiad o 2 ℃.Bydd tymheredd anelio uwch yn lleihau ffurfio dimers paent preimio a chynhyrchion amhenodol.I gael y canlyniadau gorau, dylai'r ddau preimiwr fod â gwerthoedd Tm bras.Os yw'r gwahaniaeth Tm o barau preimio yn fwy na 5 ℃, bydd y paent preimio yn dangos cychwyn ffug sylweddol trwy ddefnyddio tymheredd anelio is yn y cylchred.Os yw'r ddau primer Tm yn wahanol, gosodwch y tymheredd anelio i 5 ℃ yn is na'r Tm isaf.Fel arall, i gynyddu penodoldeb, gellir perfformio pum cylch yn gyntaf ar dymereddau anelio a gynlluniwyd ar gyfer Tm uwch, ac yna'r cylchoedd sy'n weddill ar dymheredd anelio a gynlluniwyd ar gyfer Tm is.Mae hyn yn caniatáu copi rhannol o'r templed cyrchfan o dan amodau tynn.
4. Primer purdeb a sefydlogrwydd
Mae purdeb safonol paent preimio arfer yn ddigonol ar gyfer y rhan fwyaf o gymwysiadau PCR.Mae tynnu grwpiau benzoyl ac isobutylyl trwy ddihalwyno yn fach iawn ac felly nid yw'n ymyrryd â PCR.Mae angen puro rhai cymwysiadau i ddileu unrhyw ddilyniannau nad ydynt yn llawn hyd yn y broses synthesis.Mae'r dilyniannau cwtogi hyn yn digwydd oherwydd nad yw effeithlonrwydd cemeg synthesis DNA yn 100%.Mae hon yn broses gylchol sy'n defnyddio adweithiau cemegol dro ar ôl tro wrth i bob bas gael ei ychwanegu i wneud DNA o 3′ i 5′.Gallwch chi fethu yn y naill gylchred neu'r llall.Mae gan breimwyr hirach, yn enwedig y rhai sy'n fwy na 50 gwaelod, gyfran fawr o ddilyniannau cwtogi ac efallai y bydd angen eu puro.
Mae effeithlonrwydd cemeg synthetig a dull puro yn effeithio ar gynnyrch paent preimio.Mae cwmnïau biofferyllol, megis Cytology a Shengong, i gyd yn defnyddio isafswm uned OD i sicrhau cyfanswm allbwn oligonucleoside.Mae paent preimio personol yn cael ei gludo ar ffurf powdr sych.Mae'n well ail-hydoddi'r paent preimio yn TE fel bod y crynodiad terfynol yn 100μM.Mae TE yn well na dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio oherwydd bod pH dŵr yn aml yn asidig a bydd yn achosi hydrolysis oligonucleosides.
Mae sefydlogrwydd paent preimio yn dibynnu ar amodau storio.Dylid storio powdr sych a paent preimio toddedig ar -20 ℃.Gellir storio preimwyr wedi'u toddi mewn TE ar grynodiadau mwy na 10μM yn sefydlog ar -20 ℃ am 6 mis, ond dim ond ar dymheredd ystafell (15 ℃ i 30 ℃) y gellir eu storio am lai nag 1 wythnos.Gellir storio paent preimio powdr sych ar -20 C am o leiaf 1 flwyddyn ac ar dymheredd ystafell (15 C i 30 C) am hyd at 2 fis.
5. Ensymau a'u crynodiadau
Ar hyn o bryd, y polymeras DNA Taq a ddefnyddir yn y bôn yw'r ensym peirianneg genynnau wedi'i syntheseiddio gan facteria colifform.Mae swm yr ensym sydd ei angen i gataleiddio adwaith PCR nodweddiadol tua 2.5U (yn cyfeirio at gyfanswm cyfaint yr adwaith o 100ul).Os yw'r crynodiad yn rhy uchel, gall arwain at ymhelaethu amhenodol;os yw'r crynodiad yn rhy isel, bydd swm y cynnyrch synthetig yn cael ei leihau.
6. Ansawdd a chrynodiad dNTP
Mae cysylltiad agos rhwng ansawdd dNTP a chrynodiad ac effeithlonrwydd ymhelaethu PCR.Mae'r powdr dNTP yn ronynnog, ac mae ei amrywioldeb yn colli ei weithgaredd biolegol os caiff ei storio'n amhriodol.Mae hydoddiant dNTP yn asidig, a dylid ei ddefnyddio mewn crynodiad uchel, gyda datrysiad byffer 1M NaOH neu 1M Tris.HCL i addasu ei PH i 7.0 ~ 7.5, swm bach o is-becynnu, storio wedi'i rewi ar -20 ℃.Bydd rhewi-dadmer lluosog yn diraddio dNTP.Mewn adwaith PCR, dylai dNTP fod yn 50 ~ 200umol/L.Yn enwedig, dylid rhoi sylw i grynodiad y pedwar DNTPS ddylai fod yn gyfartal (paratoad cyfartal man geni).Os yw crynodiad unrhyw un ohonynt yn wahanol i'r lleill (uwch neu is), bydd diffyg cyfatebiaeth yn cael ei achosi.Bydd crynodiad rhy isel yn lleihau cynnyrch cynhyrchion PCR.Gall dNTP gyfuno â Mg2+ a lleihau'r crynodiad o Mg2+ am ddim.
7. Templed (genyn targed) asid niwclëig
Mae maint a gradd puro asid niwclëig templed yn un o'r cysylltiadau allweddol ar gyfer llwyddiant neu fethiant PCR.Mae'r dulliau puro DNA traddodiadol fel arfer yn defnyddio SDS a proteas K i dreulio a gwaredu sbesimenau.Prif swyddogaethau SDS yw: hydoddi lipidau a phroteinau ar y gellbilen, a thrwy hynny ddinistrio'r gellbilen trwy doddi proteinau pilen, a daduno proteinau niwclear yn y gell, gall SDS hefyd gyfuno â phroteinau a gwaddod;Gall Proteas K hydrolyze a threulio proteinau, yn enwedig histones wedi'u rhwymo â DNA, ac yna defnyddio ffenol toddydd organig a chlorofform i echdynnu proteinau a chydrannau celloedd eraill, a defnyddio ethanol neu alcohol isopropyl i waddodi asid niwclëig.Gellir defnyddio'r asid niwclëig a echdynnwyd fel templed ar gyfer adweithiau PCR.Ar gyfer sbesimenau canfod clinigol cyffredinol, gellir defnyddio dull cyflym a syml i ddiddymu celloedd, lysate pathogenau, treulio a thynnu proteinau o gromosomau i genynnau targed am ddim, a'u defnyddio'n uniongyrchol ar gyfer ymhelaethu PCR.Mae echdynnu templed RNA fel arfer yn defnyddio dull guanidine isothiocyanate neu protease K i atal RNase rhag diraddiol RNA.
8.Mg2+ crynodiad
Mae Mg2+ yn cael effaith sylweddol ar benodolrwydd a chynnyrch ymhelaethu PCR.Mewn adwaith PCR cyffredinol, pan fo crynodiad amrywiol dNTP yn 200umol/L, y crynodiad priodol o Mg2+ yw 1.5 ~ 2.0mmol/L.Mae crynodiad Mg2+ yn rhy uchel, mae penodoldeb yr adwaith yn lleihau, mae ymhelaethu amhenodol yn digwydd, bydd crynodiad rhy isel yn lleihau gweithgaredd polymeras DNA Taq, gan arwain at ostyngiad mewn cynhyrchion adwaith.
Mae ïonau magnesiwm yn effeithio ar sawl agwedd ar PCR, megis gweithgaredd DNA polymeras, sy'n effeithio ar gynnyrch;Enghraifft arall yw anelio paent preimio, sy'n effeithio ar benodolrwydd.Mae dNTP a thempled yn rhwymo i ïon magnesiwm, gan leihau faint o ïon magnesiwm rhydd sydd ei angen ar gyfer actifedd ensymau.Mae'r crynodiad ïon magnesiwm gorau posibl yn amrywio ar gyfer gwahanol barau preimiwr a thempledi, ond crynodiad cychwynnol PCR nodweddiadol gyda 200μM dNTP yw 1.5mM (nodyn: Ar gyfer PCR meintiol amser real, defnyddiwch hydoddiant ïon magnesiwm 3 i 5mM gyda chwiliedydd fflwroleuol).Mae crynodiadau uwch o ïonau magnesiwm rhad ac am ddim yn cynyddu cynnyrch, ond hefyd yn cynyddu ymhelaethu amhenodol ac yn lleihau ffyddlondeb.Er mwyn pennu'r crynodiad gorau posibl, perfformiwyd titradiadau ïon magnesiwm mewn cynyddrannau o 0.5mM o 1mM i 3mM.Er mwyn lleihau'r ddibyniaeth ar optimeiddio ïon magnesiwm, gellir defnyddio polymeras DNA Platinwm Taq.Mae Platinwm Taq DNA polymeras yn gallu cynnal swyddogaeth dros ystod ehangach o grynodiadau ïon magnesiwm na Taq DNA polymeras ac felly mae angen llai o optimeiddio.
9. Pcr-hyrwyddo ychwanegion
Mae optimeiddio tymheredd anelio, dyluniad paent preimio, a chrynodiad ïon magnesiwm yn ddigonol ar gyfer ymhelaethu'n benodol iawn ar y mwyafrif o dempledi;fodd bynnag, mae angen mesurau ychwanegol ar gyfer rhai templedi, gan gynnwys y rhai sydd â chynnwys GC uchel.Mae ychwanegion sy'n effeithio ar dymheredd toddi DNA yn darparu ffordd arall o wella penodoldeb a chynnyrch cynnyrch.Mae angen dadnatureiddio'r templed yn llawn ar gyfer y canlyniadau gorau.
Yn ogystal, mae'r strwythur eilaidd yn atal rhwymiad primer ac estyniad ensym.
Mae ychwanegion PCR, gan gynnwys formamide, DMSO, glyserin, betaine, a PCRx Enhancer Solution, yn gwella ymhelaethu.Eu mecanwaith posibl yw lleihau'r tymheredd toddi, a thrwy hynny gynorthwyo anelio paent preimio a chynorthwyo ymestyn DNA polymeras trwy'r rhanbarth adeiledd eilaidd.Mae gan PCRx Solution fanteision eraill.Mae angen optimeiddio ïon magnesiwm lleiaf posibl pan gaiff ei ddefnyddio gyda phlatinwm Taq DNA polymerase a Platinum Pfx DNA polymerase.Felly, mae'r dechneg Platinwm yn cael ei gyfuno â'r ychwanegyn i gynyddu penodoldeb tra'n lleihau dibyniaeth y trydydd dull, optimization ïon magnesiwm.I gael y canlyniadau gorau, dylid optimeiddio'r crynodiad o ychwanegion, yn enwedig DMSO, formamide, a glyserol, sy'n atal Taq DNA polymeras.
10. Cychwyn poeth
Cychwyn poeth PCR yw un o'r dulliau pwysicaf o wella penodoldeb PCR yn ogystal â dylunio paent preimio da.Er mai tymheredd elongation gorau posibl Taq DNA polymeras yw 72 ℃, mae'r polymeras yn parhau i fod yn weithredol ar dymheredd ystafell.Felly, cynhyrchir cynhyrchion amhenodol pan fo'r tymheredd daliad yn is na'r tymheredd anelio wrth baratoi'r adwaith PCR ac ar ddechrau'r cylch thermol.Ar ôl eu ffurfio, mae'r cynhyrchion amhenodol hyn yn cael eu mwyhau'n effeithiol.Mae PCR cychwyn poeth yn arbennig o effeithiol pan fydd y safleoedd a ddefnyddir ar gyfer dylunio paent preimio wedi'u cyfyngu gan leoliad elfennau genetig, megis treigladau a gyfeiriwyd at y safle, clonio mynegiant, neu adeiladu a thrin elfennau genetig a ddefnyddir ar gyfer peirianneg DNA.
Dull cyffredin o gyfyngu ar weithgaredd Taq DNA polymeras yw paratoi hydoddiant adwaith PCR ar rew a'i roi mewn cyfarpar PCR wedi'i gynhesu ymlaen llaw.Mae'r dull hwn yn syml ac yn rhad, ond nid yw'n cwblhau gweithgaredd yr ensym ac felly nid yw'n dileu'n llwyr ymhelaethu ar gynhyrchion amhenodol.
Mae preimio thermol yn gohirio synthesis DNA trwy atal elfen hanfodol nes bod y cyfarpar PCR yn cyrraedd tymheredd dadnatureiddio.Mae'r rhan fwyaf o ddulliau cychwyn thermol â llaw, gan gynnwys oedi wrth ychwanegu Taq DNA polymeras, yn feichus, yn enwedig ar gyfer cymwysiadau trwybwn uchel.Mae dulliau preimio thermol eraill yn defnyddio tarian cwyr i amgáu elfen hanfodol, gan gynnwys ïonau neu ensymau magnesiwm, neu i ynysu cydrannau adweithiol yn gorfforol, megis templedi a byfferau.Yn ystod y cylch thermol, mae'r gwahanol gydrannau'n cael eu rhyddhau a'u cymysgu gyda'i gilydd wrth i'r cwyr doddi.Fel y dull cychwyn poeth â llaw, mae'r dull tarian cwyr yn feichus ac yn dueddol o gael ei halogi ac nid yw'n addas ar gyfer cymwysiadau trwybwn uchel.
Mae DNA polymeras platinwm yn gyfleus ac yn effeithlon ar gyfer cychwyn poeth awtomatig PCR.Mae polymeras Platinwm Taq DNA yn cynnwys polymeras DNA Taq ailgyfunol wedi'i gyfuno â gwrthgorff monoclonaidd yn erbyn polymeras Taq DNA.Mae'r gwrthgyrff yn cael eu llunio gan PCR i atal gweithgaredd ensymau yn ystod daliad tymheredd hir.Rhyddhawyd taq DNA polymeras i'r adwaith yn ystod inswleiddio 94 ℃ y cam dadnatureiddio, gan adfer gweithgaredd polymeras llawn.Yn wahanol i polymeras Taq DNA a addaswyd yn gemegol ar gyfer cychwyn thermol, nid oes angen insiwleiddio hir ar 94 ℃ (10 i 15 munud) ar ensym Platinwm i actifadu'r polymeras.Gyda polymeras DNA PlatinumTaq, adferwyd 90% o weithgaredd polymeras DNA Taq ar ôl 2 funud ar 94 ℃.
11. nyth-PCR
Gall rowndiau mwyhau olynol gan ddefnyddio paent preimio nythu wella penodoldeb a sensitifrwydd.Mae'r rownd gyntaf yn ymhelaethiad safonol o 15 i 20 cylch.Cafodd ffracsiwn bach o'r cynnyrch ymhelaethu cychwynnol ei wanhau 100 i 1000 o weithiau a'i ychwanegu at yr ail rownd o ymhelaethu am 15 i 20 cylch.Fel arall, gellir maint y cynnyrch chwyddedig cychwynnol trwy buro gel.Defnyddir paent preimio nythog yn yr ail rownd o ymhelaethu, a all rwymo i'r dilyniant targed y tu mewn i'r paent preimio cyntaf.Mae'r defnydd o PCR nythu yn lleihau'r posibilrwydd o ymhelaethu ar safleoedd targed lluosog oherwydd mai ychydig o ddilyniannau targed sy'n ategu'r ddwy set o breimwyr.Fe wnaeth yr un cyfanswm o gylchoedd (30 i 40) gyda'r un paent preimio chwyddo'r safleoedd amhenodol.Mae PCR nythu yn cynyddu sensitifrwydd dilyniannau targed cyfyngedig (ee, mrnas prin) ac yn gwella penodoldeb PCRS anodd (ee 5′ RACE).
12. PCR disgynnol
Mae PCR disgynnol yn gwella penodoldeb trwy ddefnyddio amodau anelio tynn ar gyfer yr ychydig gylchoedd cyntaf o PCR.Mae'r cylch yn dechrau ar dymheredd anelio tua 5 ℃ yn uwch na'r amcangyfrif Tm, yna mae pob cylch yn cael ei ostwng 1 ℃ i 2 ℃ nes bod y tymheredd anelio yn is na Tm 5 ℃.Dim ond y templed cyrchfan gyda'r homoleg uchaf fydd yn cael ei ymhelaethu.Mae'r cynhyrchion hyn yn parhau i ehangu mewn cylchoedd dilynol, gan ddileu'r cynhyrchion amhenodol chwyddedig.Mae PCR disgynnol yn ddefnyddiol ar gyfer dulliau lle nad yw graddau'r homoleg rhwng preimiwr a thempled targed yn hysbys, megis olion bysedd DNA AFLP.
Pecynnau PCR Cysylltiedig
Yr Arwr 2 × PCRTMMae gan system Mix oddefgarwch uwch i atalyddion PCR na'r system PCR Mix arferol, a gall ymdopi'n hawdd ag ymhelaethu PCR o wahanol dempledi cymhleth.Mae'r system adwaith unigryw a Taq Hero effeithlonrwydd uchel yn golygu bod gan yr adwaith PCR effeithlonrwydd ymhelaethu, penodoldeb a sensitifrwydd uwch.
Effeithlonrwydd mwyhau uwch
Mae ganddo actifedd DNA polymeras 5'→3' a gweithgaredd ec-niwcleas 5'→3', heb weithgaredd ec-niwcleas 3'→5'.
Pecyn Amser Real PCR Easyᵀᴹ-SYBR Gwyrdd I
Penodol — gall byffer wedi'i optimeiddio ac ensym Taq cychwyn poeth atal ymhelaethiad amhenodol a ffurfio pylu preimiwr
Sensitifrwydd uchel - yn gallu canfod copïau isel o'r templed
Mae'r pecyn yn defnyddio adweithydd trawsgrifio cefn Foregene unigryw a Polymerase DNA Foregene HotStar Taq ynghyd â system adwaith unigryw i wella effeithlonrwydd mwyhau a phenodoldeb yr adwaith yn effeithiol.
Amser postio: Mai-09-2023
