Mae arbrawf RT-qPCR yn cynnwys echdynnu RNA ac asesu ansawdd, trawsgrifio gwrthdro a qPCR tri cham, mae gan bob cam lawer o ragofalon, byddwn yn cyflwyno'n fanwl isod.

Ⅰ.Asesiad ansawdd RNA

Mewn arbrawf RT-qPCR, ar ôl cwblhau echdynnu RNA, mae angen gwerthuso ansawdd RNA, a dim ond ar ôl iddo gael ei gymhwyso y gellir cynnal yr arbrawf dilynol.Mae dulliau gwerthuso yn cynnwys sbectrophotometer, electrofforesis gel Agilent, dadansoddiad Agilent 2100, ymhlith y mae'r sbectrophotometer a ddefnyddir amlaf a chanfod dull electrofforesis gel agarose.Dylid nodi bod angen defnyddio'r ddau ddull hyn gyda'i gilydd i gwblhau canfod a dadansoddi crynodiad, purdeb a chywirdeb RNA, er mwyn sicrhau ansawdd RNA.

Pecyn Ynysu RNA Cysylltiedig: 

Pecyn Ynysu Cyfanswm Cell RNA

Gellir cael RNA pur iawn ac o ansawdd uchel o wahanol gelloedd diwylliedig mewn 11 munud.

Pecyn Ynysu RNA Cyfanswm Anifeiliaid

Tynnu cyfanswm RNA purdeb uchel ac o ansawdd uchel yn gyflym ac yn effeithlon o wahanol feinweoedd anifeiliaid.

Sbectroffotomedr:

Defnyddir y sbectroffotomedr yn bennaf i bennu crynodiad a phurdeb RNA, ond ni all ganfod uniondeb RNA a gweddillion genomig.Yn eu plith, mae A260/280 ac A260/230 yn baramedrau pwysig ar gyfer canfod purdeb RNA, a gellir canfod purdeb RNA yn ôl amrywiad eu gwerthoedd:

1. 1.9< A260/280< 2.1, sy'n dangos bod purdeb RNA yn dda;A260/280 <1.9, sy'n nodi y gallai fod gweddillion protein mewn RNA;A260/280> 2.1, sy'n nodi diraddiad rhannol posibl o RNA, y gellir ei gadarnhau ymhellach gan electrofforesis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, sy'n dangos bod purdeb RNA yn dda;A260/230< 2.0, sy'n nodi y gall fod gweddillion adweithyddion organig mewn RNA, megis ffenolau, ethanol neu siwgrau.

Electrofforesis gel agarose:

Gall assay electrofforesis gel agarose ddadansoddi cyfanrwydd RNA, genom a gweddillion protein, ond ni allant feintioli crynodiad RNA yn gywir na chanfod gweddillion adweithyddion organig.Cymerwch dempledi RNA ewcaryotig er enghraifft:

1. Roedd yr RNA yn destun electrofforesis gel agarose.Pe bai dim ond tri band sengl o 28sRNA, 18sRNA a 5.8sRNA ar y map gel, mae'n dangos bod yr RNA a echdynnwyd yn gyfan.Os oes ffenomen llusgo, mae'n dynodi diraddiad rhannol o RNA.

2. Os oes un band llachar rhwng y twll glud a'r band 28sRNA, efallai y bydd gweddillion DNA genomig.

3. Os yw bandiau'n ymddangos yn y twll glud, mae'n nodi y gallai fod gweddillion protein a sylweddau macromoleciwlaidd eraill.

Ⅱ. Trawsgrifiad o'r cefn

Ar ôl cwblhau echdynnu RNA, mae angen ei wrthdroi i cDNA ar gyfer arbrofion dilynol, felly mae'r cam gwrthdroi yn hanfodol.Bydd trawsgrifio o chwith yn cael ei gyflwyno o'r detholiad o drawsgrifiad gwrthdro a primer:

Detholiad trawsgrifiad gwrthdroi:

Mae'r trawsgrifiadau cefn nodweddiadol yn cynnwys AMV RTase ac MMLV RTase.Mae gan yr RNase H o AMV RTase weithgaredd cryf, hyd synthesis byr, swm synthesis isel a sefydlogrwydd thermol da (42 ~ 55 ℃).Mae gweithgaredd RNase H MMLV RTase yn wan, mae'r hyd synthesis yn hir, mae'r swm synthesis yn uchel, ac mae'r sefydlogrwydd thermol yn wael (37 ~ 42 ℃).

Oherwydd bod gan ensym RNase H swyddogaeth templed RNA diraddiol, dylid dewis MMLV â gweithgaredd RNase H gwan yn ffafriol yn ystod trawsgrifio gwrthdro, ac ar ôl peirianneg enetig yn ddiweddarach, mae sefydlogrwydd thermol MMLV wedi cyrraedd naid ansoddol.Cymryd ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV ar gyfer trawsgrifio o chwith) er enghraifft, mae'n drawsgrifiad cefn newydd a fynegir mewn bacteria wedi'u peiriannu gan E. coli gan ddefnyddio technoleg ailgyfuno genetig.Mae'n polymeras DNA ailgyfunol sy'n syntheseiddio llinyn DNA cyflenwol o RNA un edefyn, DNA, neu hybrid RNA:DNA.Nid oes ganddo unrhyw weithgaredd RNase H, sefydlogrwydd cryf, affinedd RNA cryf, a sensitifrwydd canfod uchel.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV ar gyfer trawsgrifio o chwith)

Detholiad o preimiwr:

Yn gyffredinol, mae paent preimio RT yn perthyn i dri chategori: oligo dT, paent preimio ar hap, a preimwyr genyn-benodol.Dewiswch preimwyr addas i'w defnyddio yn unol â gofynion arbrofol gwahanol.

1. Os yw'r templed o darddiad ewcaryotig a bod y cDNA hwyr yn cael ei ddefnyddio ar gyfer ymhelaethu PCR arferol, argymhellir Oligo (dT);Os mai dim ond ar gyfer qPCR y defnyddir yr arbrawf dilynol, argymhellir cymysgu Oligo (dT) â preimwyr ar hap i wella effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro.

2. Os yw'r templed yn dod o brocaryotau, dylid dewis Random Primer neu preimio genyn-benodol i'w trawsgrifio o chwith.

Ⅲ.qPCR

Ymhelaethir yn bennaf ar feintioli fflworoleuedd o ddewis dulliau meintiol, egwyddorion dylunio paent preimio, dewis ROX, cyfluniad system adwaith a gosod amodau adwaith, ac ati.

Detholiad o ddulliau meintiol:

Rhennir dulliau meintiol yn ddulliau meintiol cymharol a dulliau meintiol absoliwt.Gellir defnyddio meintioli cymharol i ganfod effaith rhai dulliau triniaeth ar fynegiant genynnau, canfod gwahaniaeth mynegiant genynnau ar wahanol adegau a chymharu gwahaniaeth mynegiant genynnau mewn gwahanol feinweoedd.Gall meintioli absoliwt ganfod faint o asid niwclëig sydd yn y firws ac yn y blaen.Wrth wneud arbrofion, rhaid inni ddewis y dulliau meintiol priodol yn ôl ein harbrofion ein hunain.

Egwyddorion dylunio cysefin:

Mae dyluniad paent preimio ar gyfer qPCR yn uniongyrchol gysylltiedig ag effeithlonrwydd ymhelaethu a phenodoldeb cynnyrch.Felly, dylunio paent preimio da yn gywir yw cam cyntaf qPCR llwyddiannus.Wrth ddylunio paent preimio, dylid rhoi sylw i'r egwyddorion canlynol wrth fodloni'r egwyddor o ddylunio paent preimio confensiynol:

1. Mae hyd y darn targed yn cael ei reoli rhwng 100 a 300 bp;

2. Dyluniad traws-exon i osgoi dylanwad DNA genomig;

3. Mae angen profi'r paent preimio a ddyluniwyd ar gyfer effeithlonrwydd ymhelaethu, a dim ond pan fydd yr effeithlonrwydd ymhelaethu yn cyrraedd y safon (90-110%) y gellir eu defnyddio ar gyfer arbrofion meintiol;

4. Mae crynodiad primer fel arfer wedi'i optimeiddio rhwng 0.1uM a 1.0uM.

Detholiad oROX:

Yn y broses o adwaith meintiol, gall ROX addasu'r gwahaniaeth llwybr optegol, gwall pibio neu wahaniaeth cyfaint a achosir gan anweddiad ac anwedd yn unffurf, gan wella ailadroddadwyedd y canlyniadau.Fodd bynnag, dylid nodi bod y dewis o ROX yn gysylltiedig â'r offeryn.Os oes gan yr offeryn qPCR y swyddogaeth o gywiro'r gwahaniaeth rhwng tyllau yn awtomatig, nid oes angen iddo ychwanegu ROX;fel arall, mae angen iddo ychwanegu cywiro ROX.Rhaid i bartneriaid bach wrth brynu adweithyddion fod yn ôl yr offeryn a ddefnyddir i ddewis y ROX cywir, osgoi camgymeriadau diweddarach.

Paratoi system adwaith:

Mae cyfeintiau adweithiau o 20ul a 50ul yn cael eu ffafrio.Dylid rhoi sylw i'r materion canlynol wrth lunio'r system:

1. Mae angen paratoi'r system adwaith trwy awyru yn y fainc waith uwch-lân, ddH newydd₂Defnyddir O ar gyfer pob arbrawf;

2. Mae angen i bob arbrawf baratoi NTC i wirio a oes llygredd yn y system, ac mae angen i bob pâr o preimwyr wneud NTC wrth baratoi'r system;

3. Er mwyn canfod a oes gweddillion gDNA yn y templed RNA, gellir paratoi NRT ar gyfer pob sampl i'w ganfod;

4. Wrth baratoi'r system, argymhellir gwneud o leiaf 3 ailadrodd technegol ar gyfer un sampl;

5. Pan fydd y templed yn cDNA, argymhellir gwanhau 5-10 gwaith i leihau effaith ataliad system trawsgrifio gwrthdro ar arbrawf qPCR.Mae'n well archwilio maint y templed yn ôl graddiant, fel bod y gwerth CT yn disgyn rhwng 20-30;

6. Darganfyddwch y nifer gofynnol o adweithiau, cynyddwch 5-10% ar sail nifer yr adweithiau, a chyfrifwch y rhif cyfluniad cyfaint;

7, mae'r system yn cael ei baratoi gan ddefnyddio'r egwyddor premix, cymysgu ar ôl centrifugation a sicrhau nad oes swigod;

8, Cyn belled ag y bo modd i ddewis nwyddau traul ategol.

Pecyn RT-qPCR Cysylltiedig