Mae'n hysbys iawn, yn y dogma canolog, mai RNA yw'r cyfryngwr trawsgrifio rhwng DNA a mynegiant protein.O'i gymharu â chanfod DNA, gall canfod RNA adlewyrchu mynegiant genynnau mewn organebau yn fwy gwrthrychol.Mae arbrofion sy'n cynnwys RNA yn cynnwys: qRT-PCR, RNA-Seq, a chanfod genynnau ymasiad, ac ati Yn seiliedig ar nodweddion RNA ei hun (mae gan gylch siwgr RNA un grŵp hydroxyl yn fwy am ddim na chylch siwgr DNA), ynghyd â nifer fawr o RNases yn yr amgylchedd, mae RNA yn fwy ansefydlog ac yn haws ei ddiraddio na DNA.Sbwriel i mewn, sbwriel allan, os nad yw ansawdd yr RNA yn dda, yna rhaid i'r canlyniadau arbrofol fod yn anfoddhaol, wedi'u hamlygu'n benodol fel data anghywir neu ailadroddadwyedd gwael.Felly, dylid rhoi mwy o sylw i brosesu RNA, ac mae cyswllt rheoli ansawdd hefyd yn bwysicach i sicrhau cywirdeb a chywirdeb data arbrofol dilynol.

Ar gyfer rheoli ansawdd RNA, yn gyffredinol mae'r dulliau a ddefnyddir yn gyffredin canlynol:

• Sbectrophotometreg
• electrofforesis gel agarose
• Biodadansoddwr Agil
• PCR meintiol fflwroleuol amser real
• Dull llifyn fflwroleuol Qubit

01 Sbectrophotometreg

Mae gan RNA fondiau dwbl cyfunedig ac mae ganddo frig amsugno ar donfedd o 260nm.Yn ôl cyfraith Lambert-Beer, gallwn gyfrifo'r crynodiad RNA o'r brig amsugno ar 260nm.Yn ogystal, gallwn hefyd gyfrifo purdeb RNA yn ôl y gymhareb o copaon amsugno 260nm, 280nm a 230nm.280nm a 230nm yw brigau amsugno proteinau a moleciwlau bach, yn y drefn honno.Dylai cymhareb purdeb RNA cymwysedig A260/A280 ac A260/A230 fod yn fwy na 2. Os yw'n llai na 2, mae'n golygu bod halogiad protein neu foleciwl bach yn y sampl RNA ac mae angen ei buro eto.Bydd ffynonellau halogiad yn effeithio ar arbrofion i lawr yr afon, megis atal effeithlonrwydd mwyhau adweithiau PCR, gan arwain at ganlyniadau meintiol anghywir.Mae purdeb RNA yn cael dylanwad mawr ar ganlyniadau dilynol, felly mae sbectrophotometreg yn gyffredinol yn gyswllt rheoli ansawdd anhepgor yn y cam cyntaf mewn arbrofion asid niwclëig.

Ffigur 1. Sbectrwm Amsugno RNA/DNA nodweddiadol

02 Electrofforesis gel agarose

Yn ogystal â phurdeb, mae uniondeb RNA hefyd yn un o'r dangosyddion pwysig ar gyfer barnu ansawdd RNA.Bydd diraddio RNA yn arwain at nifer fawr o ddarnau byr yn y sampl, felly bydd nifer y darnau RNA y gellir eu canfod yn effeithiol a'u gorchuddio gan y dilyniant cyfeirio yn cael ei leihau.Gellir gwirio uniondeb RNA trwy electrofforesis o gyfanswm RNA ar gel agarose 1%.Gall y dull hwn ffurfweddu'r gel eich hun, neu ddefnyddio'r System E-Gel™ parod ar gyfer profi cywirdeb.Mae mwy nag 80% o gyfanswm yr RNA yn RNA ribosomaidd, y mwyafrif ohono'n cynnwys rRNA 28S a 18S (mewn systemau mamaliaid).Bydd RNA o ansawdd da yn dangos dau far llachar amlwg, sef bariau llachar 28S a 18S, yn y drefn honno, ar 5 Kb a 2 Kb, a bydd y gymhareb yn tueddu i fod yn agos at 2:1.Os yw mewn cyflwr gwasgaredig, mae'n golygu y gallai'r sampl RNA fod wedi'i ddiraddio, ac argymhellir defnyddio'r dull a ddisgrifir yn ddiweddarach i brofi ansawdd RNA ymhellach.

Ffigur 2. Cymhariaeth o RNA diraddedig (lôn 2) a RNA cyfan (lôn 3) ar electrofforesis gel agarose

03 Biodadansoddwr Agil

Yn ogystal â'r dull electrofforesis gel agarose a ddisgrifir uchod, a all ein helpu i nodi uniondeb RNA yn syml ac yn gyflym, gallwn hefyd ddefnyddio'r biodadansoddwr Agilent i bennu uniondeb RNA.Mae'n defnyddio cyfuniad o ficro-hylifau, electrofforesis capilari, a fflworoleuedd i asesu crynodiad a chywirdeb RNA.Trwy ddefnyddio'r algorithm adeiledig i ddadansoddi proffil y sampl RNA, gall y biodadansoddwr Agilent gyfrifo gwerth cyfanrwydd RNA cyfeirio, Rhif Uniondeb RNA (y cyfeirir ato o hyn ymlaen fel RIN) [1].Po fwyaf yw gwerth RIN, yr uchaf yw cyfanrwydd yr RNA (mae 1 yn hynod ddiraddiol, 10 yw'r mwyaf cyflawn).Mae rhai arbrofion sy'n cynnwys RNA yn awgrymu defnyddio RIN fel paramedr ar gyfer asesu ansawdd.Gan gymryd arbrofion dilyniannu trwybwn uchel (y cyfeirir ati yma wedi hyn fel NGS) fel enghraifft, mae canllawiau Repertoire Imiwnedd Dynol Oncomine™, a ddefnyddir i ganfod derbynyddion antigen celloedd B a T yng nghyfres paneli Oncomine Thermo Fisher, yn awgrymu bod samplau â gwerthoedd RIN yn fwy na 4, gellir mesur darlleniadau a chlonau mwy effeithiol (Ffigur 3).Mae gwahanol ystodau a argymhellir ar gyfer gwahanol baneli, ac yn aml gall RIN uwch ddod â data mwy effeithiol.

Ffigur 3, yn arbrofion Repertoire Imiwnedd Dynol Oncomine™, gall samplau â RIN sy'n fwy na 4 ganfod darlleniadau mwy effeithiol a chlonau celloedd T.【2】

Fodd bynnag, mae gan y gwerth RIN rai cyfyngiadau hefyd.Er bod gan RIN gydberthynas uchel ag ansawdd data arbrofol NGS, nid yw'n addas ar gyfer samplau FFPE.Mae samplau FFPE wedi'u trin yn gemegol ers amser maith, ac yn gyffredinol mae gan yr RNA a dynnwyd werth RIN cymharol isel.Fodd bynnag, nid yw hyn yn golygu bod yn rhaid i ddata effeithiol yr arbrawf fod yn anfoddhaol.Er mwyn asesu ansawdd samplau FFPE yn gywir, mae angen i ni ddefnyddio mesuriadau heblaw RIN.Yn ogystal â RIN, gall bioanalyzer Agilent hefyd gyfrifo gwerth DV200 fel paramedr gwerthuso ansawdd RNA.Mae DV200 yn baramedr sy'n cyfrifo cyfran y darnau sy'n fwy na 200 bp mewn sampl RNA.Mae DV200 yn ddangosydd gwell o ansawdd sampl FFPE na RIN.Ar gyfer yr RNA a dynnwyd gan FFPE, mae ganddo gydberthynas uchel iawn â nifer y genynnau y gellir eu canfod yn effeithiol ac amrywiaeth y genynnau [3].Er y gall DV200 wneud iawn am y diffygion o ran canfod ansawdd FFPE, ni all y biodadansoddwr Agilent ddadansoddi'n gynhwysfawr y problemau ansawdd mewn samplau RNA o hyd, gan gynnwys a oes atalyddion yn y samplau.Gall atalyddion eu hunain effeithio ar effeithlonrwydd mwyhau arbrofion i lawr yr afon a lleihau faint o ddata defnyddiol.Er mwyn gwybod a oes atalydd yn y sampl, gallwn fabwysiadu'r dull PCR meintiol fflwroleuol amser real a ddisgrifir nesaf.

04 PCR meintiol fflwroleuol amser real

Gall y dull PCR meintiol fflwroleuol amser real nid yn unig ganfod yr atalyddion yn y sampl, ond hefyd yn adlewyrchu'n gywir ansawdd RNA yn y sampl FFPE.O'u cymharu â dadansoddwyr biolegol Agilent, mae offerynnau meintiol fflworoleuedd amser real yn fwy poblogaidd mewn labordai biolegol mawr oherwydd eu cymhwysiad ehangach.Er mwyn profi ansawdd samplau RNA, dim ond chwilwyr preimio ar gyfer genynnau cyfeirio mewnol sydd angen i ni eu prynu neu eu paratoi, fel GUSB (Cat rhif. Hs00939627).Trwy ddefnyddio'r set hon o preimwyr, stilwyr a safonau (cyfanswm RNA o grynodiad hysbys) i gynnal arbrofion meintiol absoliwt, gellir cyfrifo'r crynodiad darn RNA effeithiol fel safon gwerthuso ansawdd RNA (Meintoli RNA Swyddogaethol (FRQ) yn fyr).Mewn prawf NGS, canfuom fod gan FRQ samplau RNA gydberthynas uchel iawn â chyfaint data effeithiol.Ar gyfer pob sampl sy'n fwy na 0.2ng/uL FRQ, gall o leiaf 70% o'r darlleniadau gwmpasu'r dilyniant cyfeirio i bob pwrpas (Ffigur 4).

Ffigur 4, mae gan y gwerth FRQ a ganfyddir gan y dull meintiol fflworoleuedd gydberthynas uchel iawn (R2> 0.9) â'r data effeithiol a gafwyd yn yr arbrawf NGS.Y llinell goch yw'r gwerth FRQ sy'n hafal i 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Yn ogystal â bod yn berthnasol i samplau FFPE, gall y dull PCR meintiol amser real hefyd fonitro atalyddion mewn samplau yn effeithiol.Gallwn ychwanegu'r sampl i'w ganfod i'r system adwaith gyda Rheolaeth Bositif Fewnol (IPC) a'i Assay, ac yna perfformio meintioli fflworoleuedd i gael y gwerth Ct.Os yw'r gwerth Ct yn llusgo y tu ôl i'r gwerth Ct yn yr adwaith dim sampl, mae'n nodi bod yr atalydd yn bresennol yn y sampl ac yn atal effeithlonrwydd ymhelaethu yn yr adwaith.

05 Dull llifyn fflwroleuol Qubit

Qubit Fluorometer yw'r ddyfais fach a ddefnyddir amlaf ar gyfer canfod crynodiad asid niwclëig a phurdeb, sy'n hawdd ei weithredu ac sy'n bodoli ym mron pob labordy bioleg moleciwlaidd.Mae'n cyfrifo crynodiad asid niwclëig yn gywir trwy ganfod a llifyn fflwroleuol sy'n rhwymo asid niwclëig (adweithydd canfod Qubit).Mae gan Qubit sensitifrwydd a phenodoldeb uchel, a gall fesur RNA yn gywir i lawr i grynodiad pg/µL.Yn ogystal â'r gallu adnabyddus i feintioli crynodiad asid niwclëig yn gywir, gall model newydd diweddaraf Thermo Fisher, Qubit 4.0, hefyd ganfod cyfanrwydd RNA.Mae system canfod RNA Qubit 4.0′ (RNA IQ Assay) yn canfod cyfanrwydd RNA trwy ganfod dau liw fflwroleuol penodol ar yr un pryd.Gall y ddau liw fflwroleuol hyn glymu i ddarnau mawr a darnau bach o RNA, yn y drefn honno.Mae'r ddau liw fflwroleuol hyn yn dynodi cyfran y darnau mawr o RNA yn y sampl, ac o hyn gellir cyfrifo'r gwerth IQ (Cywirdeb ac Ansawdd) sy'n cynrychioli ansawdd yr RNA.Mae'r gwerth IQ yn berthnasol i samplau FFPE a samplau nad ydynt yn FFPE, ac mae ganddo ddylanwad mawr ar ansawdd dilyniannu dilynol.Gan gymryd arbrofion NGS fel enghraifft, yn yr arbrofion prawf RNA-Seq a gynhaliwyd ar y platfform Ion torrent™, roedd gan y rhan fwyaf o samplau â gwerthoedd IQ uwch na 4 o leiaf 50% o ddarlleniadau effeithiol (Ffigur 5).O'i gymharu â'r dulliau canfod uchod, mae Qubit IQ Assay nid yn unig yn fwy cyfleus i weithredu ac yn cymryd llai o amser (o fewn pum munud), ond mae ganddo hefyd gydberthynas wych rhwng y gwerth paramedr IQ mesuredig ac ansawdd data arbrofion i lawr yr afon.

Ffigur 5, mae cydberthynas fawr rhwng gwerth IQ Qubit RNA a'r darlleniadau mapiedig o RNA-Seq.【5】

Trwy'r cyflwyniad uchod, credaf fod gan bawb ddealltwriaeth ddigonol o wahanol ddulliau rheoli ansawdd RNA.Yn ymarferol, gallwch ddewisy dull cyfatebol yn ôl y math o sampl ac offerynnau presennol.Dim ond trwy reoli ansawdd RNA yn dda y gallwn osgoi methiant arbrofion dilynol a achosir gan ansawdd sampl gwael, gan arbed amser, ynni a chost gwerthfawr.

Cynhyrchion cyfeirio:

Pecyn Ynysu RNA Cyfanswm Anifeiliaid

Pecyn Ynysu Cyfanswm Cell RNA

cyfeiriadau

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.Yr RIN: rhif cyfanrwydd RNA ar gyfer aseinio gwerthoedd cyfanrwydd i fesuriadau RNA.Biol Moleciwlaidd BMC 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Canllaw Defnyddiwr Repertoire Imiwnedd Dynol Oncomine (Rhif Tafarn. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】 Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Metrigau Ansawdd Gwell ar gyfer Asesu RNA sy'n Deillio o Samplau Meinweoedd Paraffin-Mewnblanedig Paraffin-Sefydlog Archifol, Gwyddorau Gwenwynegol, Cyfrol 170, – Rhifyn 2 3, Awst 170, Rhifyn 3 3https://doi.org/10.1093/toxsci/