1. Dealltwriaeth gychwynnol

Ar y cam hwn, mae angen inni ddeall rhai cysyniadau a therminoleg, er mwyn osgoi gwneud camgymeriadau o flaen ein pobl hŷn, megis:

C: Beth yw'r gwahaniaeth rhwng RT-PCR, qPCR, PCR amser real, ac RT-PCR amser real?

Ateb: PCR trawsgrifio gwrthdro yw RT-PCR(trawsgrifiad cefn PCR, RT-PCR), sy'n amrywiad a ddefnyddir yn eang o adwaith cadwyn polymeras (PCR).Yn RT-PCR, mae llinyn RNA yn cael ei drawsgrifio i'r chwith yn DNA cyflenwol, a ddefnyddir wedyn fel templed ar gyfer ymhelaethu DNA gan PCR.
Amser real-PCR a qPCR(Meintiol Rea-ltime-PCR) yr un peth, mae'r ddau yn PCR meintiol amser real, sy'n golygu bod gan bob cylch o PCR gofnodion data amser real, felly gellir addasu nifer y templedi cychwyn dadansoddiad manwl gywir.

Er ei bod yn ymddangos bod PCR amser real (PCR meintiol fflwroleuol amser real) a thrawsgrifio Gwrthdro PCR (PCR trawsgrifio gwrthdro) yn cael eu talfyrru fel RT-PCR, y confensiwn rhyngwladol yw: Mae RT-PCR yn cyfeirio'n benodol at drawsgrifio gwrthdroYn gyffredinol, mae PCR, PCR amser real yn cael ei dalfyrru fel qPCR (PCR meintiol amser real).

Ac amser real RT-PCR (RT-qPCR), Dyma'r PCR trawsgrifio cefn ynghyd â'r dechnoleg feintiol fflwroleuol: cael cDNA (RT) yn gyntaf o drawsgrifiad gwrthdro RNA, ac yna defnyddio PCR amser real ar gyfer dadansoddiad meintiol (qPCR).Mae'r rhan fwyaf o labordai yn gwneud RT-qPCR, hynny yw, ymchwil ar is-reoleiddio mynegiant RNA, felly mae'r qPCR y mae pawb yn siarad amdano yn y labordy mewn gwirionedd yn cyfeirio at RT-qPCR, ond peidiwch ag anghofio bod llawer o brofion DNA o hyd mewn cymwysiadau clinigol.Dadansoddiad meintiol, megis canfod firws hepatitis B HBV.

Cwestiwn: Ar ôl darllen llawer o PCR meintiol fflwroleuol, pam y dylid rheoli'r darn chwyddedig o fewn yr ystod o 80-300bp?

Ateb: Mae hyd pob dilyniant genynnau yn wahanol, mae rhai yn sawl kb, mae rhai yn gannoedd o bp, ond dim ond 80-300bp y mae angen i hyd y cynnyrch fod wrth ddylunio paent preimio, nid yw'n rhy fyr neu'n rhy hir yn addas ar gyfer canfod PCR meintiol fflwroleuol.Mae'r darn cynnyrch yn rhy fyr i'w wahaniaethu oddi wrth y primer-dimer.Mae hyd y primer-dimer tua 30-40bp, ac mae'n anodd gwahaniaethu a yw'n primer-dimer neu'n gynnyrch os yw'n llai na 80bp.Os yw'r darn cynnyrch yn rhy hir, yn fwy na 300bp, bydd yn hawdd arwain at effeithlonrwydd ymhelaethu isel ac ni all ganfod swm y genyn yn effeithiol.

Er enghraifft, pan fyddwch chi'n cyfrif faint o bobl sydd mewn ystafell ddosbarth, does ond angen i chi gyfrif faint o gegau sydd.Mae'r un peth yn wir pan fyddwch yn canfod genynnau, dim ond angen i chi ganfod dilyniant penodol o enyn i gynrychioli Bydd y dilyniant cyfan yn ei wneud.Os ydych chi am gyfrif pobl, mae angen i chi gyfrif ceg a thrwynau, clustiau a sbectol, ac mae'n hawdd gwneud camgymeriadau.

Er mwyn ehangu, mewn ymchwil fiolegol, mae yna lawer o achosion ymchwil o bwynt i ardal, oherwydd bod dilyniant genynnau unrhyw rywogaeth yn hir iawn, mae'n ddiangen ac yn amhosibl mesur pob darn, megis dilyniant bacteriol 16S, sef cynnal y dilyniant ceidwadol o facteria Assays i gasglu nifer y boblogaeth benodol o facteria.

C: Beth yw'r hyd gorau posibl ar gyfer dyluniad preimiwr qPCR?

Ateb: A siarad yn gyffredinol, mae hyd y primer tua 20-24bp, sy'n well.Wrth gwrs, rhaid inni roi sylw i werth TM y paent preimio wrth ddylunio'r paent preimio, oherwydd mae hyn yn gysylltiedig â'r tymheredd anelio gorau posibl.Ar ôl llawer o arbrofion, profwyd bod 60°C yn werth TM gwell.Os yw'r tymheredd anelio yn rhy isel, bydd yn hawdd arwain at ymhelaethu amhenodol.Os yw'r tymheredd anelio yn rhy uchel, bydd yr effeithlonrwydd ymhelaethu yn gymharol isel, bydd brig y gromlin ymhelaethu yn cychwyn yn ddiweddarach, a bydd y gwerth CT yn cael ei ohirio.

C: Sut mae'r dull lliwio yn wahanol i'r dull stiliwr?

Ateb: Dull lliwioNid yw rhai llifynnau fflwroleuol, megis SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ac ati, yn allyrru golau ar eu pen eu hunain, ond byddant yn allyrru fflworoleuedd ar ôl eu rhwymo i'r rhigol fach o DNA llinyn dwbl.Felly, ar ddechrau'r adwaith PCR, ni all y peiriant ganfod y signal fflwroleuol.Pan fydd yr adwaith yn cyrraedd y cam anelio-estyniad, caiff y llinyn dwbl ei agor, a chaiff llinyn newydd ei syntheseiddio o dan weithred DNA polymeras, ac mae'r moleciwl fflwroleuol yn rhwymo i'r rhigol leiaf dsDNA.Wrth i nifer y cylchoedd PCR gynyddu, mae mwy a mwy o liwiau'n cael eu cyfuno â DNA llinyn dwbl, ac mae'r signal fflwroleuol hefyd yn cael ei wella'n barhaus.Defnyddir y dull lliwio yn bennaf mewn ymchwil wyddonol.
PS: Byddwch yn ofalus wrth wneud yr arbrawf, mae'n rhaid cyfuno'r llifyn â DNA dynol, byddwch yn ofalus i'w droi'n berson fflwroleuol.

Dull lliwio (chwith) Dull archwilio (dde)
PS: Byddwch yn ofalus wrth wneud yr arbrawf, mae'n rhaid cyfuno'r llifyn â DNA dynol, byddwch yn ofalus i'w droi'n berson fflwroleuol.

SYBR Gwyrdd Ⅰ yn clymu i'r rhigol leiaf o DNA

Dull archwiliostiliwr Taqman yw'r chwiliwr hydrolysis a ddefnyddir amlaf.Mae grŵp fflwroleuol ar ben 5′ y stiliwr, fel arfer FAM, ac mae'r stiliwr ei hun yn ddilyniant sy'n ategu'r genyn targed.Mae grŵp diffodd fflwroleuol ar y pen 3′.Yn ôl yr egwyddor o drosglwyddo egni cyseiniant fflworoleuedd (trosglwyddiad egni cyseiniant Förster, FRET), pan fydd y grŵp fflworoleuol gohebydd (moleciwl fflworoleuol rhoddwr) a'r grŵp fflwroleuol quenching (derbynnydd moleciwl fflworoleuol) yn gyffrous Pan fydd y gorgyffwrdd sbectra a'r pellter yn agos iawn (7-10nm), gall excitation y moleciwl rhoddwr fflworoleuol yn derbyn tra bod y moleciwl fflworoleuol yn derbyn. gwanhau.Felly, ar ddechrau'r adwaith PCR, pan fydd y stiliwr yn rhydd ac yn gyfan yn y system, ni fydd y grŵp fflworoleuol gohebydd yn allyrru fflworoleuedd.Wrth anelio, mae'r paent preimio a'r stiliwr yn clymu i'r templed.Yn ystod y cam ymestyn, mae'r polymeras yn syntheseiddio cadwyni newydd yn barhaus.Mae gan DNA polymeras 5′-3′ actifedd exonuclease.Wrth gyrraedd y stiliwr, bydd y DNA polymeras yn hydroleiddio'r stiliwr o'r templed, yn gwahanu'r grŵp fflwroleuol adroddwr oddi wrth y grŵp fflwroleuol quencher, ac yn rhyddhau'r signal fflwroleuol.Gan fod perthynas un-i-un rhwng y stiliwr a'r templed, mae'r dull stiliwr yn well na'r dull lliwio o ran cywirdeb a sensitifrwydd y prawf.Defnyddir y dull archwilio yn bennaf wrth wneud diagnosis.

C: Beth yw meintioli absoliwt?Beth yw Meintioli Cymharol?

Ateb: Mae meintioliad absoliwt yn cyfeirio at gyfrifo rhif copi cychwynnol y sampl i'w brofi gan qPCR, megis faint o firysau HBV sydd mewn 1ml o waed.Y canlyniad a geir trwy feintoli cymharol yw'r newid yn swm y genyn targed mewn sampl benodol o'i gymharu â sampl cyfeiriol arall, ac mae mynegiant y genyn wedi'i reoleiddio i fyny neu wedi'i is-reoleiddio.

C: A fydd faint o echdynnu RNA, effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro, ac effeithlonrwydd ymhelaethu yn effeithio ar y canlyniadau arbrofol?
C: A fydd storio sampl, adweithyddion echdynnu, adweithyddion trawsgrifio gwrthdro, a nwyddau traul sy'n trosglwyddo golau yn effeithio ar y canlyniadau arbrofol?
C: Pa ddull all gywiro'r data arbrofol?

O ran y materion hyn, byddwn yn eu disgrifio'n fanwl yn yr adrannau uwch ac uwch isod.
2. Gwybodaeth uwch

O ran PCR meintiol fflwroleuol amser real, rhaid inni gydnabod y realiti bod miloedd o bapurau ymchwil gwyddonol yn cael eu cyhoeddi bob blwyddyn, ac ymhlith y rhain nid yw'r dechnoleg PCR meintiol fflwroleuol yn nifer fach.

Os nad oes safon gyffredin i fesur yr arbrawf PCR meintiol fflwroleuol, gall y canlyniadau amrywio'n fawr.Ar gyfer yr un genyn o'r un rhywogaeth, gyda'r un dull prosesu, bydd y canlyniadau canfod hefyd yn amrywio'n fawr, a bydd yn anodd i hwyrddyfodiaid ailadrodd yr un canlyniadau.Chi Does neb yn gwybod pa un sy'n iawn a pha un sy'n anghywir.

A yw hyn yn golygu bod PCR meintiol fflwroleuol yn dechnoleg twyllo neu'n dechnoleg annibynadwy?Na, mae hyn oherwydd bod PCR meintiol fflwroleuol yn fwy sensitif ac yn fwy cywir, a bydd ychydig o weithrediad anghywir yn cynhyrchu canlyniadau hollol groes.Mae colled fechan fil o filltiroedd i ffwrdd.Gall awdur yr erthygl gael ei arteithio dro ar ôl tro gan yr adolygwyr.Ar yr un pryd, mae adolygwyr y cyfnodolyn hefyd yn anodd dewis o wahanol ganlyniadau arbrofol.

Ar y cyfan, gan dynnu sylw at ddiffyg consensws mewn arbrofion PCR amser real.I'r perwyl hwn, dechreuodd uwch wyddonwyr yn y diwydiant lunio safonau,ei gwneud yn ofynnol i gyfranwyr ddarparu rhai manylion arbrofion a phrosesu data angenrheidiol (gan gynnwys data angenrheidiol) yn yr erthygl i fodloni'r safonau hyn .

Gall adolygwyr farnu ansawdd yr arbrawf trwy ddarllen y manylion hyn;gall darllenwyr y dyfodol hefyd ddefnyddio hwn i ailadrodd yr arbrawf neu wella'r arbrawf.Yna mae'r canlyniadau arbrofol a geir yn y modd hwn yn llawn gwybodaeth, o ansawdd uchel, ac yn ddefnyddiadwy.

MIBBI (Isafswm Gwybodaeth ar gyfer Ymchwiliadau Biolegol a Biofeddygol -http://www.mibbi.org) ddaeth i fodolaeth.Mae MIBBI yn brosiect sy'n darparu safonau ar gyfer arbrofion.Fe'i cyhoeddir mewn natur.Mae'r prosiect hwn wedi'i anelu at arbrofion biolegol amrywiol, gan gynnwys bioleg celloedd, Microarray, qPCR rydym yn mynd i'w drafod nawr, ac ati, ac mae'n darparu ar gyfer pob math o arbrawf wrth gyflwyno llawysgrifau.Dylid darparu’r wybodaeth honno bob amser.

Yn y prosiect MIBBI, mae dwy erthygl yn ymwneud â PCR meintiol fflwroleuol, sef:
·RDML (Iaith Marcio Data PCR Amser Real) – canllaw iaith ac adrodd strwythuredig ar gyfer data PCR meintiol amser real;
·MIQE (Isafswm Gwybodaeth ar gyfer Cyhoeddi Arbrofion PCR Amser Real Meintiol) – isafswm gwybodaeth ar gyfer cyhoeddi erthyglau am arbrofion PCR meintiol amser real.
Yn gyntaf, gadewch i ni siarad am RDML, y fanyleb derminoleg.

Os nad oes diffiniad safonol i bopeth, mae’n amhosib parhau â’r drafodaeth, a dyna pam mae’r esboniad o dermau mor bwysig yn yr arholiad.
Mae'r derminoleg a ddefnyddir yn yr arbrawf PCR meintiol fflwroleuol yn cynnwys y cynnwys canlynol.Mae QIAGEN wedi gwneud y crynodeb gorau i ni.Mae'r canlynol i gyd yn sychnwyddau .

Cromlin ymhelaethu
Mae'r gromlin ymhelaethu yn cyfeirio at y gromlin a wnaed yn ystod y broses PCR, gyda'r rhif cylchred fel yr abscissa a'r dwysedd fflworoleuedd amser real yn ystod yr adwaith fel y gyfesuryn.

Dylai fod gan gromlin chwyddo ragorol y nodweddion canlynol: mae'r llinell sylfaen yn wastad neu wedi gostwng ychydig, ac nid oes tuedd amlwg ar i fyny;mae pwynt ffurfdro'r gromlin yn glir, ac mae llethr y cyfnod esbonyddol yn gymesur â'r effeithlonrwydd ymhelaethu.Po fwyaf yw'r llethr, yr uchaf yw'r effeithlonrwydd ymhelaethu;y gromlin ymhelaethu cyffredinol Mae'r parallelism yn dda, sy'n dangos bod effeithlonrwydd ymhelaethu pob tiwb yn debyg;mae cam esbonyddol cromlin ymhelaethu samplau crynodiad isel yn amlwg.

Gwaelodlin (gwaelodlin)
Y llinell sylfaen yw lefel sŵn y cylch cynnar, a fesurir fel arfer rhwng y 3ydd a'r 15fed cylch, oherwydd ni ellir canfod y cynnydd mewn gwerth fflworoleuedd a achosir gan y cynnyrch ymhelaethu yn ystod y cyfnod hwn.Gellir amrywio nifer y cylchoedd a ddefnyddir i gyfrifo'r llinell sylfaen ac efallai y bydd angen eu lleihau os defnyddir symiau templed uchel neu os yw lefel mynegiant y genyn targed yn uchel.

Mae gosod y llinell sylfaen yn gofyn am weld data fflworoleuedd o'r gromlin ymhelaethu llinoledd .Mae'r llinell sylfaen wedi'i gosod fel bod twf y gromlin ymhelaethu yn dechrau gyda rhif cylch sy'n fwy na rhif brig y cylch llinell sylfaen.Mae angen gosod llinellau sylfaen yn unigol ar gyfer pob dilyniant targed.Mae angen tynnu'r gwerthoedd fflworoleuedd cyfartalog a ganfyddir yn y cylchoedd cynnar o'r gwerthoedd fflworoleuedd a geir yn y cynhyrchion chwyddedig.Mae'r fersiynau diweddaraf o amrywiol feddalwedd PCR Amser Real yn caniatáu optimeiddio gosodiadau gwaelodlin yn awtomatig ar gyfer samplau unigol.

Yn ystod ychydig gylchoedd cyntaf yr adwaith mwyhau PCR, nid yw'r signal fflworoleuedd yn newid llawer.Gelwir dynesu at linell syth yn waelodlin, ond os edrychwn yn fanwl ar yr ychydig gylchoedd cyntaf, gwelwn mai o fewn y llinell sylfaen yw'r hyn sy'n digwydd yn y llun isod.

Cefndir Mae'r cefndir yn cyfeirio at
y gwerth fflworoleuedd amhenodol yn yr adwaith .Er enghraifft: diffodd fflworoleuedd aneffeithlon;neu nifer fawr o dempledi DNA llinyn dwbl oherwydd y defnydd o SYBR Green.Mae cydrannau cefndir y signal yn cael eu tynnu'n fathemategol gan yr algorithm meddalwedd PCR Real-Time.

Arwydd gohebydd
Mae signal gohebydd yn cyfeirio at y signal fflwroleuol a gynhyrchir gan SYBR Green neu chwiliedyddion dilyniant-benodol wedi'u labelu'n fflwroleuol yn ystod PCR Amser Real.

Signal Gohebydd Wedi'i Normaleiddio (RN)
Mae RN yn cyfeirio at ddwysedd fflworoleuedd llifyn y gohebydd wedi'i rannu â dwyster fflworoleuedd y llifyn cyfeirio goddefol a fesurir ym mhob cylchred.

Dye Cyfeirnod Goddefol
Mewn rhai PCRs Amser Real,defnyddir y llifyn fflwroleuol ROX fel cyfeiriad mewnol i normaleiddio'r signal fflwroleuol.Mae'n cywiro ar gyfer amrywiadau oherwydd pibellau anghywir, lleoliad ffynnon, ac amrywiadau fflworoleuedd fesul ffynnon.

Y trothwy fflworoleuedd (trothwy)
wedi'i addasu uwchlaw'r gwerth cefndir ac yn sylweddol is na gwerth llwyfandir y gromlin ymhelaethu.Rhaid iddo fod yn rhanbarth llinol y gromlin ymhelaethu, gan gynrychioli'r ystod log-llinol o ganfod PCR.Dylid gosod trothwyon yn y golwg cromlin ymhelaethu log fel bod cam llinol log PCR yn hawdd ei adnabod.Os oes genynnau targed lluosog mewn PCR Amser Real, rhaid gosod y trothwy ar gyfer pob targed .Yn gyffredinol, defnyddir signal fflworoleuedd y 15 cylch cyntaf o adwaith PCR fel y signal cefndir fflworoleuedd, ac mae'r trothwy fflworoleuedd 10 gwaith yn fwy na gwyriad safonol signal fflworoleuedd y 3 i 15 cylch cyntaf o PCR, ac mae'r trothwy fflworoleuedd wedi'i osod yng nghyfnod esbonyddol ymhelaethu PCR.Yn gyffredinol, mae gan bob offeryn ei drothwy fflworoleuedd wedi'i osod cyn ei ddefnyddio.

Trothwy Beiciau (CT) neu Bwynt Croesfan (CP)
Y cylch lle mae'r gromlin chwyddo yn croesi'r trothwy (hy, y pwynt lle mae canfod fflworoleuedd yn cynyddu'n sylweddol).Gall CT fod yn ffracsiwn a gellir cyfrifo swm y templed cychwynnol.Mae'r gwerth CT yn cynrychioli nifer y cylchoedd a brofir pan fydd y signal fflwroleuol ym mhob tiwb adwaith PCR yn cyrraedd y trothwy penodol.Mae perthynas llinol rhwng gwerth CT pob templed a logarithm rhif copi cychwynnol y templed, yyn uwch y rhif copi cychwynnol, y lleiaf yw'r gwerth CT, ac i'r gwrthwyneb.Gellir gwneud cromlin safonol trwy ddefnyddio safon gyda rhif copi cychwynnol hysbys, lle mae'r abscissa yn cynrychioli'r gwerth CT, a'r mesuryn yn cynrychioli logarithm rhif y copi cychwynnol.Felly, cyn belled â bod gwerth CT y sampl anhysbys yn cael ei sicrhau, gellir cyfrifo rhif copi cychwynnol y sampl o'r gromlin safonol.

Δ CT gwerth
Mae gwerth ΔCT yn disgrifioy gwahaniaeth rhwng y genyn targed a'r gwerth CT genyn cyfeirio mewndarddol cyfatebol, fel genyn cadw tŷ, ac fe'i defnyddir i normaleiddio faint o dempled a ddefnyddir:
⇒ΔCT = CT (genyn targed) – CT (genyn cyfeirio mewndarddol)

ΔΔ CT Gwerth
Mae'r gwerth ΔΔCT yn disgrifio'r gwahaniaeth rhwng gwerth cymedrig ΔΔCT sampl o ddiddordeb (ee, celloedd ysgogol) a gwerth ΔΔCT cymedrig sampl cyfeirio (ee, celloedd heb eu symbylu).Gelwir y sampl cyfeirio hefyd yn sampl graddnodi a chaiff pob sampl arall ei normaleiddio i hyn ar gyfer meintioli cymharol:
⇒ΔΔCT = ΔCT cyfartalog (sampl o ddiddordeb) – ΔCT cyfartalog (sampl cyfeirio)

Genynnau cyfeirio mewndarddol (genynnau cyfeirio mewndarddol)
Nid yw lefelau mynegiant genynnau cyfeirio mewndarddol, megis genynnau cadw tŷ (genynnau cadw tŷ), yn gwahaniaethu rhwng samplau.Mae cymharu gwerthoedd CT y genyn cyfeirio â'r genyn targed yn caniatáu i lefel mynegiant y genyn targed gael ei normaleiddio i faint o RNA mewnbwn neu cDNA (gweler yr adran ar werthoedd ΔCT uchod).

Genynnau cyfeirio mewnol yn gywir ar gyferdiraddio RNA posibl neu bresenoldeb atalyddion ensymau mewn samplau RNA, yn ogystal ag amrywiadau mewn cynnwys RNA, effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro, adferiad asid niwclëig, a thrin sampl.I ddewis y genyn(au) cyfeirio optimaidd, fe wnaethom addasu'r algorithm i ganiatáu iddo ddewis y cyfeirnod optimaidd yn dibynnu ar y gosodiad arbrofol.

Rheolaeth fewnol
Dilyniant rheoli sy'n cael ei fwyhau yn yr un adwaith â'r dilyniant targed a'i archwilio â stiliwr gwahanol (hy, perfformio PCR deublyg).Defnyddir rheolaethau mewnol yn aml i ddiystyru ymhelaethiadau a fethwyd, megis pan na chaiff y dilyniant targed ei ganfod.
Sampl Calibradu
Sampl cyfeirio (er enghraifft, RNA wedi'i buro o linell gell neu feinwe) a ddefnyddir mewn meintioli cymharol i gymharu'r holl samplau eraill i bennu lefel mynegiant cymharol genyn.Gall y sampl graddnodi fod yn unrhyw sampl, ond fel rheol mae'n rheolydd (er enghraifft, sampl heb ei drin neu sampl o sero amser yr arbrawf).

Rheolaethau cadarnhaol
defnyddio adweithiau rheoli gydasymiau hysbys o dempled.Defnyddir rheolyddion positif yn aml i wirio bod set preimio neu set primiwr-prob yn gweithio'n iawn a bod yr adwaith wedi'i osod yn gywir.

Dim Rheoli Templedi (NTC)
Adwaith rheoli sy'n cynnwys holl gydrannau angenrheidiol yr adwaith mwyhau ac eithrio'r templed, sydd fel arfer yn cael ei ddisodli â dŵr.Gall defnyddio NTC ddod o hyd i'r halogiad a achosir gan halogiad adweithydd neu DNA tramor, gan sicrhau dilysrwydd a dibynadwyedd y data canfod.Mae ymhelaethu ar y rheolaeth NTC yn dynodi halogiad.

Dim rheolaeth RT (NRT)
Gall proses echdynnu RNA gynnwys DNA genomig gweddilliol, sy'n hynod niweidiol ac sy'n droseddwr sy'n effeithio ar ansawdd data a gelyn naturiol qPCR, felly wrth ddylunio arbrofion, rhaid ei gynllunio i ymhelaethu ar ganfod RNA yn unig.Mae dwy ffordd, un yw dylunio paent preimio ar draws intronau, a'r llall yw tynnu DNA yn llwyr, pa un sy'n well, a fydd yn cael ei drafod yn nes ymlaen.Mae'r rheolaeth NTR yn ddrych hud i ganfod llygredd DNA.Os oes mwyhad, mae'n golygu bod llygredd.

Safonau
Safonau yw samplau o rif crynodiad neu gopi hysbys a ddefnyddir i lunio cromlin safonol.Er mwyn sicrhau sefydlogrwydd y safon, mae'r darn genyn fel arfer yn cael ei glonio i'r plasmid a'i ddefnyddio fel y safon.

Y gromlin safonol
fel arfer yn cael ei wanhau i o leiaf 5 graddiant crynodiad gyda'r cynnyrch safonol yn ôl y gymhareb dyblu, a 5 pwynt yn cael eu tynnu yn y cyfesurynnau gwerth CT a rhif copi, ac mae'r pwyntiau wedi'u cysylltu i ffurfio llinell i gynhyrchu cromlin safonol.Ar gyfer pob cromlin safonol, mae angen gwirio ei ddilysrwydd.Mae gwerth y llethr yn disgyn rhwng –3.3 a –3.8, a pherfformir pob crynodiad yn driphlyg.Dylid dileu pwyntiau sy'n sylweddol wahanol i bwyntiau eraill.Mae gwerth CT y sampl sydd i'w brofi yn cael ei ddwyn i mewn i'r gromlin safonol, a gellir cyfrifo lefel mynegiant y sampl sydd i'w brofi.

Mae gwerth CT y sampl sydd i'w brofi yn cael ei ddwyn i'r gromlin safonol, a gellir cyfrifo rhif copi cychwynnol y sampl sydd i'w brofi.

Effeithlonrwydd a Llethr
Mae llethr y gromlin safonol yn cynrychioli effeithlonrwydd PCR amser real.
·Mae llethr o -3.322 yn dangos bod effeithlonrwydd ymhelaethu PCR yn 1, neu 100% yn effeithlon, ac mae maint y cynnyrch PCR yn dyblu ym mhob cylchred.
·Mae llethr llai na –3.322 (ee, –3.8) yn dynodi effeithlonrwydd PCR
·Mae llethr sy'n fwy na –3.322 (ee, –3.0) yn dangos bod yr effeithlonrwydd PCR yn ymddangos yn fwy na 100%, sy'n chwilfrydig, sut gallai un cylchred o PCR gynhyrchu mwy na dwbl y cynnyrch chwyddedig?Mae'r sefyllfa hon yn digwydd yng nghyfnod aflinol yr adwaith PCR, hynny yw, mae yna lawer iawn o ymhelaethu amhenodol.

cromlin toddi
Ar ôl i'r ymhelaethiad qPCR gael ei gwblhau, caiff y cynnyrch PCR ei gynhesu.Wrth i'r tymheredd godi, mae'r cynnyrch ymhelaethu dwy-sownd yn toddi'n raddol, gan arwain at ostyngiad mewn dwyster fflworoleuedd.Pan gyrhaeddir tymheredd penodol (Tm), bydd nifer fawr o gynhyrchion yn toddi.Mae fflworoleuedd yn disgyn yn sydyn.Mae gan wahanol gynhyrchion PCR werthoedd Tm gwahanol a thymereddau toddi gwahanol, fel y gellir nodi penodoldeb PCR.

Cromlin toddi (cromlin ddeilliadol)
Mae'r gromlin doddi yn deillio i ffurfio map brig, a all arddangos sefyllfa darnau cynnyrch PCR yn fwy greddfol.Gan mai'r tymheredd toddi yw gwerth Tm y darn DNA, gellir barnu rhai paramedrau sy'n effeithio ar werth Tm y darn DNA, megis maint y darn, cynnwys GC, ac ati. Yn gyffredinol, yn ôl ein hegwyddorion dylunio paent preimio,mae hyd y cynnyrch chwyddedig yn yr ystod o 80-300bp, felly dylai'r tymheredd toddi fod rhwng 80 ° C a 90 ° C.

Dehongli'r gromlin doddi: Os yw'r unig brif frig yn ymddangos rhwng 80 ° C-90 ° C, mae'n golygu bod y PCR meintiol fflwroleuol yn berffaith;os yw'r prif frig yn ymddangos rhwng 80 ° C-90 ° C a bod copaon amrywiol yn ymddangos o dan 80 ° C, ystyrir y dimer preimio yn y bôn.Gallwch geisio cynyddu'r tymheredd anelio i'w ddatrys;os yw'r prif frig yn ymddangos rhwng 80°C-90°C, a'r brig amrywiol yn ymddangos eto pan fydd y tymheredd yn codi, yn y bôn ystyrir bod halogiad DNA, ac mae angen tynnu DNA yn ystod cam cychwynnol yr arbrawf.

Wrth gwrs, mae yna rai sefyllfaoedd annormal o hyd, a fydd yn cael eu dadansoddi fesul un isod.
3. Gwybodaeth uwch

I wneud qPCR, mae'n rhaid i mi ddweud MIQE,Gwybodaeth Lleiafar gyfer CyhoeddiMeintiolPCR Amser RealArbrofion —y wybodaeth leiaf ar gyfer cyhoeddi erthyglau am PCR meintiol amser realarbrofion.Er mwyn symleiddio dealltwriaeth pawb, byddwn yn symleiddio'r cynnwys allweddol.

Gallwch chwilio testun gwreiddiol MIQE ar y Rhyngrwyd, a'r peth pwysicaf yw ei fod yn nodi'rrhestr wirio data y mae angen ei darparu wrth gyhoeddi erthygl .

Gall adolygwyr farnu ansawdd yr arbrawf trwy ddarllen y manylion hyn;gall darllenwyr y dyfodol hefyd ddefnyddio hwn i ailadrodd neu wella'r arbrawf.
Mae'n werth nodi bod pwysigrwydd pob rhestr wedi'i farcio ag E neu D yn y drefn honno yn y rhestr hon.Beth mae'n ei olygu?E: gwybodaeth hanfodol (rhaid ei chyflwyno);D: gwybodaeth ddymunol (rhowch gymaint â phosibl).

MIQE (1)—Cynllun Arbrofol
Ni fydd llawer o sgumbags sydd wedi cwblhau eu hamddiffyniad ar ôl gorffen eu hastudiaethau graddedig yn gwybod sut i ddylunio arbrawf yn annibynnol, agor eu llyfrau nodiadau, a gwneud yr hyn y mae'r athro yn dweud wrthynt am ei wneud.O ganlyniad, nid oedd y dyluniad arbrofol yn drylwyr, a dywedodd adran olygyddol y cylchgrawn eu bod am wneud y llun hwn a'r llun hwnnw, felly fe wnaethant hynny mewn syfrdan.Dyma sut mae'r sgumbags yn cael eu gwneud!

Yn nes adref, egwyddor gyntaf yr arbrawf yw penderfynutrylwyredd y rhesymeg arbrofol.Y peth mwyaf sylfaenol yw'r dyluniad arbrofol, a'r peth pwysicaf am y dyluniad arbrofol yw sut i osod y sampl targed, sampl cyfeirio (rheolaeth), a nifer yr ailadroddiadau, fel y gellir cyfeirio at y data arbrofol, yn gymaradwy, ac yn argyhoeddiadol.

Y sampl targedyn cyfeirio at y sampl sy'n ei gwneud yn ofynnol i ni ganfod y genyn targed ar ôl triniaeth benodol.Y sampl cyfeirioyw'r sampl heb unrhyw driniaeth, y cyfeirir ato'n aml fel math gwyllt mewn bioleg.

Atgynhyrchiadau arbrofolyn bwysig iawn.Yn gyffredinol, rhaid i nifer yr atgynhyrchiadau perswadiol fod yn fwy na thri.Mae angen gwahaniaethu rhwng yr hyn sy'n ddyblygu biolegol a'r hyn sy'n atgynhyrchu technegol.

Atgynhyrchiadau Biolegol: Yr un arbrawf dilysu wedi'i wneud gyda gwahanol ddeunyddiau (amser, planhigion, sypiau, platiau adwaith).

Dyblygu biolegol
Gadewch i ni gymryd y driniaeth plaladdwyr o bupur fel enghraifft.Rydyn ni am chwistrellu plaladdwyr ar dri phlanhigyn ABC, yna mae tri phlanhigyn ABC yn dri chopi biolegol, ac maen nhw'r un arbrawf dilysu a gynhaliwyd gyda gwahanol ddeunyddiau.Ond fel arbrawf, mae angen rheolaeth yn bendant, felly gallwn chwistrellu un o ganghennau planhigyn A i ffurfio grŵp arbrofol o blanhigyn A, a pheidio â chwistrellu canghennau eraill planhigyn A i ffurfio grŵp rheoli.Gwnewch yr un peth ar gyfer B a C.

Atgynhyrchiadau Technegol (Atgynhyrchiadau Technegol): Mae'n arbrawf ailadroddus a gynlluniwyd i osgoi gwallau a achosir gan weithrediad, sydd mewn gwirionedd yn dwll dyblyg wedi'i gynnwys yn yr un deunydd.Rhaid i'r ddau driniaeth a rheolyddion gael gosodiadau dyblyg (lleiafswm tri) o'r genyn targed a'r genyn cyfeirio mewnol.

Ailadrodd technegol
Cymerwch y pupur wedi'i drin â phlaladdwyr fel enghraifft eto.Ar gyfer y grŵp arbrofol o blanhigyn A, gwnaethom dri thwll PCR o 1, 2, a 3 ar gyfer ei genyn targed a genyn cyfeirio mewnol yn y drefn honno, er mwyn cymryd y cyfartaledd ar ôl y canfod.Ar gyfer rheoli gwaith mae Grwpiau A hefyd yn cael eu trin yn yr un modd.Yn yr un modd, gwnewch yr un driniaeth ar gyfer planhigion B a C.Mae hwn yn ailadrodd technegol.

Mae'n werth nodi hynnyyr hyn sy'n mynd i mewn i'r ystadegau yw'r ailadrodd biolegol, a'r ailadrodd technegol yw profi a oes unrhyw ffenomenau ar hap yn y broses arbrofol, er mwyn gwneud y canlyniadau arbrofol yn gredadwy, hynny yw, er mwyn osgoi gwallau trwy gymryd eu cyfartaledd fel y dywedwn yn aml.

Rheolaethau Negyddol - NTC a NRT
NTC (Dim Rheoli Templed), rheolydd heb dempled, yn cael ei ddefnyddio i wirio a yw'r deunydd arbrofol wedi'i halogi.Yn gyffredinol, defnyddir dŵr fel templed.Os oes adwaith fflwroleuol, mae'n dangos bod halogiad asid niwclëig wedi digwydd yn y labordy.

Daw'r llygreddau hyn o: ddŵr amhur, adweithyddion heb gymhwyso sy'n cynnwys DNA mewndarddol, llygredd paent preimio, llygredd offer labordy, llygredd aerosol, ac ati, mae angen defnyddio sborionwyr RNase ac atalyddion RNase.Llygredd aerosol yw'r un anoddaf i'w ddarganfod.Dychmygwch fod eich labordy fel mwrllwch, gyda gwahanol asidau niwclëig yn hongian yn yr aer.

NRT (Dim-Cefn Trawsgrifiad), y rheolaeth heb drawsgrifiad gwrthdro, yw'r RNA trawsgrifiedig nad yw'n wrthdroi fel rheolaeth negyddol, sef rheoli gweddillion gDNA.

Wrth wneud mynegiant genynnau, canfyddir swm yr RNA trwy ganfod faint o cDNA ar ôl trawsgrifio gwrthdro.Os oes gweddillion gDNA pan fydd RNA yn cael ei buro, bydd yn achosi gwallau yn y canlyniadau arbrofol, oherwydd y canlyniadau gwirioneddol a geir yw gDNA a cDNA.Ar y lefel gyfanredol, nid dim ond cDNA, mae angen dileu gDNA yn gyfan gwbl yn ystod echdynnu RNA.

MIQE (2) - gwybodaeth sampl
Mae'r wybodaeth sampl fel y'i gelwir yn golygu, pan fyddwn yn cyhoeddi erthygl am qPCR, rhaid inni esbonio'r wybodaeth sampl yn glir, sy'n rhan anhepgor o'r erthygl.Yn yr un modd, pan fyddwn yn prosesu samplau, rhaid inni hefyd reoleiddio ein gweithrediadau ein hunain i sicrhau dilysrwydd y samplau.

Dim ond canlyniad yw disgrifiad y sampl, a dylem dalu mwy o sylw i'r deunyddiau a gymerwyd yn ystod yr arbrawf cyfan.

Detholiad o ddeunyddiau arbrofol
Samplau gwaed - dewiswch waed ffres, dim mwy na 4 awr.Samplau celloedd – dewis casglu celloedd ffres mewn cyfnod o dyfiant egnïol.Meinwe Anifeiliaid - Dewiswch feinwe ffres sy'n tyfu'n egnïol.Meinwe Planhigion – Dewiswch feinwe ifanc, ffres.

Mae'n rhaid eich bod wedi sylwi bod gair allweddol yn yr ychydig frawddegau hyn: ffres .
Ar gyfer y samplau uchod, y pecyn gorau, cost-effeithiol a sefydlog ar y farchnad yw cit Foregene, sy'n gallu echdynnu eu DNA a'u RNA yn gyflym ac yn hawdd.

Cit Bach DNA gwaed

Pecyn Ynysu Cyfanswm Cell RNA

Pecyn Ynysu RNA Cyfanswm Anifeiliaid

Planhigion Pecyn Ynysu RNA Cyfanswm

Plannu Pecyn Ynysu RNA Cyfanswm Plws

Pecyn Ynysu DNA Planhigion

Storio deunyddiau arbrofol
A siarad yn gyffredinol, nid ydym yn argymell storio samplau, os yw amodau'n caniatáu.Fodd bynnag, mae yna lawer o ffrindiau na allant gynnal arbrofion yn syth ar ôl samplu, ac mae angen i rai hyd yn oed gludo tanciau nitrogen hylifol i'r cae i'w samplu.

Ar gyfer y math hwn o ffrind sy'n gweithio'n galed, ni allaf ond dweud nad ydych yn deall nwyddau traul adweithydd.Nawr mae llawer o gwmnïau traul adweithydd yn cynhyrchu adweithyddion a all storio samplau RNA ar dymheredd ystafell, a gallwch ddewis eu defnyddio.Y dull storio confensiynol yw storio nitrogen hylifol, gan ddefnyddio tanc nitrogen hylifol bach sy'n hawdd ei gario.Ar ôl dod â'r sampl yn ôl i'r labordy, storiwch ef mewn oergell -80 ° C.

Ar gyfer arbrofion sy'n cynnwys RNA, rhaid dilyn yr egwyddor chwe gair:tymheredd isel, dim ensymau,acyflym .

Mae'r cysyniad o dymheredd isel yn hawdd ei ddeall;heb ensymau, mae RNase ym mhobman yn y byd rydyn ni'n byw ynddo (fel arall byddech chi wedi cael eich lladd gan HIV), felly mae sut i osgoi RNase wrth wneud arbrofion yn gysyniad pwysig iawn;cyflym,Nid oes Kung Fu yn y byd na ellir ei dorri, dim ond cyflymder na ellir ei dorri.

Felly, mewn ffordd, y byrraf yw'r amser echdynnu, y gorau yw'r pecyn.Pam maeForegeneMae cit yn pwysleisio cyflymder, oherwydd eu bod yn ei adnabod yn dda.

ON: Mae rhai merched yn gwneud arbrofion yn ofalus iawn, ond dydyn nhw ddim cystal â slam dunk ar ôl sawl blwyddyn o waith.Maen nhw'n teimlo bod Duw yn annheg, yn cwyno am eraill, ac yn edrych am fywyd.Yn wir, nid oedd hi'n ei ddeall.Wnaeth o ddim amddiffyn yr RNA yn dda, ac roedd y chwaraewr slam dunk yn heini.Pan oedd yn gwneud yr arbrawf, meddyliodd y byddai'n gorffen y slam dunk gyda thair gwaith, pum gwaith a dwy adran, ond gwnaeth yr arbrawf yn dda.

Nodyn: Arafach, mwy o siawns o oresgyniad RNase.Sut i hyfforddi eich hun i fod yn gyflym?Nid oes unrhyw ffordd, dim ond ymarfer mwy.

Ar gyfer gwahanol arbrofion a samplau gwahanol, mae angen darllen mwy o lenyddiaeth o hyd a dewis dull priodol ar gyfer prosesu.Ar gyfer y broses casglu a storio sampl, mae MIQE yn mynnu bod yn rhaid iddo gael ei ysgrifennu'n glir yn y papur, fel y gall yr adolygwyr adolygu dibynadwyedd y papur, ac mae hefyd yn gyfleus i'r bobl ifanc syfrdanu ailadrodd eich arbrawf.

Er bod arbrofion biolegol yn anodd, maent yn rhai pen uchel.Os nad ydych chi'n ofalus, gallwch chi wrthdroi'r byd.Er enghraifft, gwneud SARS yn argyfwng biocemegol, neu wneud reis hybrid i arbed 1.3 biliwn o bobl.Mae'r llun isod yn arbrawf cemegol, dylech ddeall pa mor falch ydych chi o'ch ymchwil dim ond trwy edrych ar ei ymddangosiad tebyg i dick.Anghofiwch, peidiwch â'i dduo.

MIQE (3) – echdynnu asid niwclëig.
Mae echdynnu asid niwcleig yn ddigwyddiad mawr, ac mae pob arbrawf bioleg moleciwlaidd yn dechrau gydag echdynnu asid niwclëig.Yn gyntaf oll, gadewch i ni gopïo cynnwys MIQE ar echdynnu asid niwclëig.

O edrych ar y ffurflen hon, ni allwch aros ar yr wyneb.Dogma yw'r ffurflen.I fod yn fyfyriwr gorau, rhaid ichi ofyn pam.Cynnwys hanfodol y tabl hwn yw: Ymlidpurdeb, uniondeb, cysondeb, a swm echdynnu RNA .

Mae rhan gyntaf yproses neu offeryn yw'r cam echdynnu asid niwclëig.Os ydych chi'n defnyddio echdynnydd asid niwclëig awtomatig i echdynnu (uwch, cysylltwch â mi i'w brynu), mae angen i chi nodi enw model yr offeryn.

Enw'r cit a

pa git a ddefnyddiwyd ar gyfer y manylion newid, pa adweithyddion arbennig a ychwanegwyd neu pa weithrediadau arbennig a wnaed, dylid eu hesbonio'n glir fel y gall eraill ailadrodd eich arbrawf yn hawdd.

Mae rhai pobl yn ychwanegu rhai adweithyddion arbennig wrth echdynnu samplau arbennig, gan feddwl mai dyma eu harf cyfrinachol a pheidiwch â dweud wrth eraill.Wrth ei gadw'n gyfrinachol, maen nhw hefyd yn colli'r cyfle i wneud i'ch erthygl ddisgleirio.Peidiwch â bod yn glyfar, mae'n rhaid i chi fod yn fwy gonest na'r hen wlad Zhang mewn ymchwil wyddonol, os ydych chi am fod yn glyfar, bydd yr erthygl yn eich gwneud chi'n dwp.

rhaid cofio rhif cynnyrch y citpan fyddwch yn archebu'r cit ac yn ysgrifennu'r erthygl.Yn gyffredinol, mae dau rif ar y pecyn: Cat - rhif catalog (rhif y cynnyrch, rhif yr erthygl), Lot - rhif lot cynnyrch ( Fe'i defnyddir i nodi o ba swp y daeth y cynnyrch).

Yn ogystal, defnyddir y rhif CAS yn aml wrth archebu adweithyddion biocemegol, a byddaf yn ei boblogeiddio gyda'i gilydd.Y rhif CAS yw'r rhif a roddir gan Gymdeithas Cemegol America i bob cyffur cemegol newydd.Yn gyffredinol, mae tri rhif wedi'u cysylltu â llinell doriad.Rhif CAS Rushui: 7732-18-5.Yn aml mae gan gemegau aliasau lluosog, ond mae'r rhif CAS yn unigryw.Wrth archebu meddyginiaeth, gallwch wirio ei rif CAS yn gyntaf.

Yn nes adref, pam fod yn rhaid inni ddisgrifio’r pethau hyn yn glir?Mewn gwirionedd, mae hefyd i wirio ansawdd echdynnu RNA.Bydd defnyddio offerynnau a chitiau yn gwneud echdynnu RNA yn fwy cyson.Nid yw graddfa echdynnu labordai cyffredin yn fawr, a gellir ei gael gyda chitiau.

Manylion triniaeth DNAse neu RNase
Mater pwysig PCR meintiol fflwroleuol yw atal halogiad DNA, a pheidiwch ag arbrofi os oes halogiad.Felly, mae'n hollbwysig nodi'r broses a ddefnyddiwyd gennych i brosesu'r DNA, er mwyn dangos bod y DNA yn y broses arbrofol wedi'i dynnu'n llwyr ac yn gyfan gwbl.a gynrychiolir gan ddiagram sgematig.

Diagram sgematig o RNA a DNA
Yn gyffredinol, y dull ar gyfer tynnu DNA yw trin RNA â DNA ar ôl echdynnu.Fodd bynnag, mae'r rhain yn ddulliau cymharol hen.Mae pecynnau echdynnu RNA masnachol wedi gallu tynnu DNA yn ystod y broses echdynnu heb ychwanegu DNase.Er enghraifft, cyfres o gitiau o Foregene .

Nodyn: Mae tynnu DNA yn ystod echdynnu RNA yn gleddyf dwy ymyl peryglus iawn, a fydd yn ymestyn amser gweithredu echdynnu RNA ac yn cynyddu'r risg o ddiraddio RNA.Yn y bôn, mae'n gyfaddawd rhwng cynnyrch RNA a phurdeb.

Yn ogystal, mae faint o DNase a ychwanegir at y golofn arsugniad sy'n seiliedig ar silica yn fach iawn, a rhaid defnyddio DNase o ansawdd uchel i gyflawni'r effaith.Ni ellir treulio DNA heb ei optimeiddio yn gyflym ac yn gyfan gwbl.Mae hwn yn brawf o lefel dechnegol y masnachwr.Wrth gwrs, mae hyd yn oed mwy o fasnachwyr rhyfedd sy'n brolio y gellir tynnu DNA heb DNase.Gellir dweud bod unrhyw un sy'n brolio y gellir tynnu DNA yn gyfan gwbl heb DNase yn hwligan.Mae DNA yn strwythur llinyn dwbl cymharol sefydlog, ac ni ellir ei ddileu trwy siarad a chwerthin yn unig.

Asesiad halogiad
dull asesu: canfod electrofforesis, agarose 1%, 6V/cm, 15 munud, llwytho 1-3 ul

Dadansoddiad meintiol asid niwcleig
fel arfer yn cael ei fesur gan ddefnyddio sbectrophotometer UV.Gadewch imi yn gyntaf boblogeiddio ystyr y tri gwerth OD260, OD280, ac OD230.
·OD260nm: Dyma donfedd amsugno uchafbwynt amsugno uchaf asid niwclëig, ac mae'r gwerth mesuredig gorau yn amrywio o 0.1 i 1.0.Os na, gwanwch neu grynodwch y sampl i ddod ag ef o fewn yr ystod.
·OD280nm: Dyma donfedd amsugno'r brig amsugno uchaf o brotein a sylweddau ffenolig.
·OD230nm: Dyma donfedd amsugno'r brig amsugno uchaf o garbohydradau.

Nesaf, gadewch i ni siarad am rôl pob dangosydd.Ar gyfer A260, gellir ei ddefnyddio i fesur cynnyrch asid niwclëig.Pan fydd OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Ar gyfer purdeb, mae angen inni edrych ar y cymarebau a welwn yn gyffredin: OD260/280 ac OD260/230.
·DNA pur: Mae OD260/280 bron yn hafal i 1.8.Pan fydd yn fwy na 1.9, mae'n nodi bod llygredd RNA, a phan fydd yn llai na 1.6, mae'n nodi bod llygredd protein a ffenol.
· RNA pur: 1.7
·OD260/230: P'un a yw'n DNA neu'n RNA, y gwerth cyfeirio yw 2.5.Pan fydd yn llai na 2.0, mae'n dangos bod llygredd siwgr, halen a mater organig.

Uniondeb RNA

Mae'n bwysig iawn mesur cyfanrwydd RNA.Yn gyffredinol, mae angen gwneud arbrawf gel dadnatureiddio RNA i wirio a yw'r disgleirdeb rhwng RNA 28S a 18S yn berthynas ddeublyg.Pan fydd y trydydd band 5S yn ymddangos, mae'n golygu bod yr RNA wedi dechrau diraddio, heblaw am infertebratau.

Data ar gyfer asesu ansawdd RNA: Yn ogystal â'r profion uchod, mae yna hefyd rai profion offeryn mwy datblygedig o ran cywirdeb RNA, megis prawf uniondeb RQI system electrofforesis awtomatig Experion, a all ganfod a yw RNA wedi'i ddiraddio'n anweledig.

Mewn ymchwil wyddonol, mae PCR meintiol fflwroleuol yn gymhariaeth rhwng y genyn targed a'r genyn cyfeirio mewnol.Felly, yn y broses o gadw sampl RNA, echdynnu RNA, ac ati, y prif nod yw sicrhau cywirdeb RNA.

Mae'n hawdd deall sut mae cyfanrwydd RNA yn effeithio ar y cydbwysedd rhwng y genyn targed a'r genyn cyfeirio mewnol o'r ffigur isod.Bydd diraddio yn arwain at anghyflawnder genynnau, boed yn anghyflawnder y genyn cyfeirio mewnol neu anghyflawnder y genyn targed, bydd yn cael effaith fawr ar y data.

Ni ddylai diagram sgematig o'r genyn targed a'r genyn cyfeirio fod yn wir

Prawf atal (p'un a yw'r gwerth CT yn cael ei atal o dan grynodiad uchel neu isel neu amodau eraill)

Gan gymryd y ffigur hwn fel enghraifft, mae gwerthoedd Ct y pum cromlin fel a ganlyn.Mae dosbarthiad gwerthoedd CT rhwng y cromliniau yn anwastad, ac mae'r gwerthoedd Ct yn cael eu gohirio o dan grynodiadau uchel ac isel, sef achos ataliad PCR.

Pwynt allweddol: Yn y broses o echdynnu RNA, mae angen inni roi'r gorau i gamsyniadau a sefydlu rhai cywir.

Y syniad anghywir yw: Mae echdynnu RNA yn mynd ar drywydd y cnwd yn unig, gan feddwl po fwyaf yw'r swm o RNA a geir, y gorau.Mewn gwirionedd, pan fyddwn yn meintioli, os nad yw nifer y genynnau yn fawr iawn, nid oes angen llawer o RNA arnom.Mae swm yr RNA rydych chi'n ei dynnu yn fwy na digon.

Y cysyniad cywir yw:Dylai echdynnu RNA fynd ar drywydd purdeb, uniondeb a chysondeb.Gall purdeb sicrhau nad yw'r trawsgrifiad gwrthdro dilynol yn cael ei atal ac na fydd DNA yn effeithio ar y data.Mae uniondeb yn sicrhau cydbwysedd dilyniannau targed a chyfeiriadau mewnol.Mae cysondeb yn sicrhau llwytho sampl sefydlog.

MIQE (4) – trawsgrifiad o chwith
Camsyniad: mynd ar drywydd cyfaint sampl uwch.
Cysyniad cywir: Mynd ar drywydd cysondeb (sefydlogrwydd), waeth faint o RNA llwytho, mae effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro yn parhau i fod yn gyson, gan sicrhau y gall gwahaniaethau mewn cDNA wirioneddol adlewyrchu gwahaniaethau mewn mRNA.
Rydym yn esbonio'r broses hon gyda diagram sgematig:

Diagram sgematig o effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro, peidiwch â bod yn wir
Yn gyntaf oll, mae angen inni ddeall y gwahaniaeth rhwng y broses trawsgrifio o chwith a'r broses PCR.Mae PCR yn mynd trwy brosesau gwresogi ac anelio lluosog, ac mae'r darn targed yn tyfu'n esbonyddol;er nad oes gan drawsgrifio o chwith y broses hon, gallwn ddychmygu bod trawsgrifio gwrthdro mewn gwirionedd yn un-i-un Yn ystod y broses atgynhyrchu, cymaint o ddarnau o RNA

gan y gellir cael cymaint o ddarnau o Wybodaeth cDNA, dylid ei ddeall erbyn hyn, oherwydd mae darnau mawr a bach wedi'u trawsgrifio o chwith, ac mae'n amhosibl canolbwyntio ar un darn.Ac oherwydd bod swm yr RNA yn gymharol fach, mae swm y cDNA a geir hefyd yn gymharol fach, yn wahanol i PCR, sydd ag effaith ymhelaethu, felly mae'n amhosibl ei ganfod yn y bôn.

canlyniadau electrofforesis cDNA
Yn ail, yn ddelfrydol, mae trawsgrifio o chwith yn cael ei berfformio un-i-un, ond ni all unrhyw drawsgrifiad gwrthdro gan unrhyw gwmni gyflawni'r effaith hon.Yn y bôn, mae effeithlonrwydd y rhan fwyaf o drawsgrifiadau gwrthdro yn crwydro rhwng 30-50%.Os yw hyn yn wir, byddai'n well gennym gael effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro cymharol sefydlog, sef yr hyn yr ydym am ei weld yn y ffigur: mae 3 RNA yn cael 2 cDNA, mae 6 RNA yn cael 4 cDNAs, felly ni waeth faint o sampl sy'n cael ei lwytho, mae'r effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro yn gymharol sefydlog.Nid ydym am weld y sefyllfa lle mae effeithlonrwydd trawsgrifio o chwith yn ansefydlog a lle mae crynodiad uchel yn cael ei atal.

Felly, sut i wirio a yw'r effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro yn sefydlog?Mae'r dull yn syml iawn, dim ond prawf cymhariaeth y mae angen i chi ei wneud: un yw gwrthdroi trawsgrifio i cDNA ar ôl dyblu gwanhau RNA, a'r llall yw gwneud gwanhau dyblu ar ôl trawsgrifio gwrthdroi i cDNA, ac yna gwnewch qPCR i weld y llethr a gafwyd A yw'n gyson.Fel myfyriwr gorau, dylech ei ddeall mewn eiliadau.Fel y dangosir isod:

Gwanhau RNA a cDNA i brofi a yw effeithlonrwydd trawsgrifio o chwith yn sefydlog
Trawsgrifiad gwrthdroi a'r pecyn
Sut y gall PCR meintiol fflwroleuol berffaith gael trawsgrifiad a phecyn gwrthdro rhagorol.Rhennir trawsgrifiad o'r cefn yn fras yn ddau fath yn ôl y ffynhonnell, AMV neuM-MLV, ac mae eu perfformiad yr un fath â'r hyn a ddangosir yn y tabl.

Gweithgaredd RNase H
RNase H yw Ribonuclease H, yr enw Tsieineaidd yw ribonuclease H, sef endoribonuclease sy'n gallu hydrolysio RNA yn benodol yn y gadwyn hybrid DNA-RNA.Ni all RNase H hydroleiddio'r bondiau ffosffodiester mewn DNA neu RNA un edefyn neu edefyn dwbl, hynny yw, ni all dreulio DNA neu RNA llinyn sengl neu ddwbl.Fe'i defnyddir yn gyffredin wrth synthesis ail linyn cDNA.

Mae'n beth rhyfedd.Rydym yn dweud bod gan transcriptase cefn weithgaredd RNase H, nid bod trawsgrifiad cefn yn cynnwys RNase H, ac efallai na fydd yn bosibl gwahanu RNase H oddi wrth transcriptase gwrthdro, efallai oherwydd cydffurfiad grwpiau penodol mewn trawsgrifiad cefn.

Felly, waeth beth fo effeithlonrwydd trawsgrifio cefn uwch AMV, mae ei weithgaredd RNase H yn lleihau cynnyrch cDNA.Wrth gwrs, mae gweithgynhyrchwyr adweithyddion yn optimeiddio eu cynhyrchion yn gyson i ddileu gweithgaredd RNase H mewn trawsgrifiad gwrthdro cymaint â phosibl i gynyddu cynnyrch cDNA.
Tymheredd anelio

Strwythur eilaidd RNA ar dymereddau gwahanol
Gweler y ffigur uchod ar gyfer strwythur eilaidd RNA ar wahanol dymereddau, a defnyddiwch yr offeryn ar-lein mFold i bennu strwythur eilaidd y darn targed o dan amodau tymheredd a chrynodiad halen penodol.Ar 55 ° C, mae strwythur eilaidd yr RNA yn dal yn gymhleth iawn, ni all trawsgrifiad gwrthdroi weithio, ac ni ellir datrys y strwythur eilaidd yn llwyr tan 65 ° C, tra bod tymheredd gorau AMV a M-MLV yn llawer is na'r tymheredd hwn.
beth i'w wneud?Y strwythur eilaidd yw paru cyflenwol y templed ei hun, sy'n arwain at gystadleuaeth gref rhwng y primer a'r transcriptase gwrthdro a'r templed, gan arwain at gyfres o broblemau megis E isel ac ailadroddadwyedd gwael.

beth i'w wneud?Cynyddwch y tymheredd anelio cymaint â phosibl yn unig.

Mae llawer o weithgynhyrchwyr adweithyddion yn gwella eu trawsgrifiad cefn trwy beirianneg enetig.Mae rhai yn cynyddu tymheredd yr adwaith, megis Jifan ac Aidelai, ac mae rhai yn tynnu'r grŵp gweithredol o ensym RNase H i wella'r affinedd rhwng yr ensym a'r templed RNA.Gall affinedd uchel wasgu'r strwythur eilaidd allan yn gystadleuol a darllen drwodd yn esmwyth, a hefyd wella effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro yn fawr.
Pwynt allweddol: Mae trawsgrifio gwrthdro yn bwysicach er mwyn dilyn cysondeb effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro (rhaid i ensymau nid yn unig fod yn effeithlon ond hefyd yn sefydlog), yn hytrach na faint o sampl sy'n cael ei lwytho, os nad yw'n PCR meintiol fflwroleuol arbennig o fawr, ni fydd yn bosibl o gwbl.cDNAs lluosog.
Mae gwneuthurwyr amrywiol hefyd wedi gwneud rhai ymdrechion i geisio cysondeb.Er enghraifft, mae'r rhan fwyaf o gwmnïau bellach wedi pecynnu trawsgrifiad o chwith fel pecyn safonol ar werth, sy'n ddewis da.
Er enghraifft, pecynnau RT Easy Series Foregene:

RT Easy I (rhag-gymysgedd meistr ar gyfer pecyn synthesis cDNA llinyn cyntaf)

MIQE (5) – gwybodaeth genynnau targed

Mae'r ffigwr uchod yn egluro
1. Yn gyffredinol, gellir gwirio a yw'r genyn hwn yn effeithiol ar gyfer arbrofion ailadroddus trwy arbrofion ailadroddus.
2. ID genynnau, chi'n gwybod.
3. Hyd genynnau, nid yw cyfanswm hyd y genyn targed yn bendant yn broblem.Wrth ddylunio paent preimio, sicrhewch fod hyd yr amplicon rhwng 80-200bp i sicrhau gwell effeithlonrwydd ymhelaethu.
4. Gwybodaeth cymharu Sequence Blast, mae angen cymharu'r genyn targed yn y banc genynnau i atal ymhelaethu amhenodol.
5. Presenoldeb pseudogenes.Dilyniant DNA tebyg i enyn normal yw ffuggen ond mae'n colli ei swyddogaeth arferol.Mae'n aml yn bodoli yn y teulu aml-genyn o ewcaryotau.Fe'i cynrychiolir fel arfer gan ψ.Mae'n gopi DNA genomig anweithredol yn y genom sy'n debyg iawn i'r dilyniant genyn codio., yn gyffredinol nid ydynt wedi'u trawsgrifio, ac nid oes ganddynt unrhyw ystyr ffisiolegol clir.
6. Lleoliad paent preimio mewn perthynas ag ecsonau ac intronau.Yn y blynyddoedd cynnar, pan wnaethom ddatrys y broblem o halogiad DNA, roeddem yn aml yn talu sylw i leoliadau paent preimio, ecsonau ac intronau, ac yn gyffredinol ystyriwyd dylunio paent preimio ar draws intronau i osgoi ymhelaethu ar DNA.Gweler y ffigur isod: mae du yn cynrychioli introns, mae blues amrywiol yn cynrychioli exons, pinc yn cynrychioli paent preimio cyffredin, ac mae coch llachar yn cynrychioli paent preimio sy'n rhychwantu mewntron.

Sgematig, byth yn wir
Am gynllun perffaith mae hwn yn ymddangos, ond mewn gwirionedd, yn y rhan fwyaf o achosion, nid yw'r paent preimio traws-intron mor hudolus ag a ddychmygwyd, a byddant hefyd yn achosi ymhelaethu amhenodol.Felly'r ffordd orau o atal halogiad DNA yw tynnu DNA yn gyfan gwbl.
7. Rhagfynegiad cydffurfiad.Gan ddefnyddio'r enghraifft hon eto, defnyddiwch yr offeryn ar-lein mFold i bennu strwythur eilaidd y darn targed ar dymheredd penodol a chrynodiad halen.

Strwythur eilaidd RNA ar dymereddau gwahanol
Y strwythur eilaidd yw paru cyflenwol y templed ei hun, a fydd yn arwain at gystadleuaeth gref rhwng y paent preimio a pharu templed, ac mae'r siawns o rwymo paent preimio yn llai, gan arwain at gyfres o broblemau megis E isel ac ailadroddadwyedd gwael.Trwy ragfynegiad meddalwedd, os nad oes problem strwythur eilaidd, byddai hynny'n wych.Os oes, bydd ein herthygl ddilynol yn trafod yn benodol sut i ddatrys y broblem hon.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides

Ar gyfer PCR meintiol fflwroleuol, y peth cyntaf rydych chi'n cael trafferth ag ef bob dydd yw echdynnu RNA, ac efallai mai'r ail beth yw dyluniad paent preimio.
Yn gyntaf oll, rydym yn dal i wirio'r rheolau ynghylch dylunio paent preimio yn ôl rhestr wirio MIQE.Mae mor syml fel y gall y scumbags chwerthin, a gallwn ei orffen mewn un frawddeg: darganfyddwch ddilyniant a lleoliad yr archwiliwr paent preimio a'r dull addasu.Ar gyfer y dull puro primer, mae synthesis primer mor rhad ar hyn o bryd, mae qPCR yn deilwng o ddulliau puro TUDALEN ac uwch, ac nid yw gwybodaeth yr offeryn synthesis yn bwysig.Mae llawer o bobl wedi bod yn gwneud paent preimio ers degawdau ac nid ydynt yn gwybod mai ABI3900 yw'r syntheseisydd.
O ran egwyddorion dylunio paent preimio, nid oes rhaid i chi eu cofio ar y cof, oherwydd gall y rhan fwyaf o feddalwedd dylunio paent preimio neu offer ar-lein ofalu am y problemau hyn (offeryn ar-lein a argymhellir primer3.ut.ee/), ac nid yw 99.999% o ddyluniad paent preimio yn cael ei wneud â llaw Edrychwch, mae'r awdur weithiau'n dylunio cannoedd o baent preimio y dydd, os byddwch chi'n darllen fesul un, fe ddaw'n groes i un.
Gwiriwch y pwyntiau canlynol ar ôl i'r paent preimio gael ei ddylunio:
1. Dyluniad paent preimio yn agos at y diwedd 3′: Yn achos defnyddio paent preimio oligo dT ar gyfer synthesis llinyn cyntaf cDNA, gan ystyried yr effeithlonrwydd trawsgrifio cefn a chywirdeb RNA, mae angen dylunio'r paent preimio a ddyluniwyd yn agos at y pen 3′ i wella effeithlonrwydd ymhelaethu.Defnyddiwch lun i egluro fel a ganlyn (does dim ffordd o ddeall hyn):

Pam y dylid dylunio paent preimio yn agos at y pen 3′, ni ddylai fod yn wir
2. Gwerth TM: Mae'r gwerth Tm ar 55-65 ° C (oherwydd y gweithgaredd exonuclease yw'r uchaf ar 60 ° C), ac mae'r cynnwys GC ar 40% -60%.
3. BLAST: Er mwyn osgoi ymhelaethu amhenodol ar y genom, rhaid defnyddio Blast ar gyfer dilysu atodol.

MIQE(7) — proses qPCR

1. qPCR pecyn
Yn ôl gofynion MIQE, rhaid inni ddisgrifio'n glir yr amodau adwaith cyflawn yn yr erthygl, gan gynnwys cyfluniad y system adwaith PCR, pa becyn a ddefnyddir, pwy yw'r gwneuthurwr, pa mor fawr yw'r system adwaith, p'un a yw'r dull lliwio neu'r dull stiliwr yn cael ei ddefnyddio, gosodiadau rhaglen PCR.Bydd gyrwyr cyn-filwyr yn bendant yn canfod, cyn belled â bod y cit yn cael ei ddewis, bod y wybodaeth uchod yn cael ei phennu yn y bôn.
Ar hyn o bryd, mae cynhyrchu a chynhyrchu pecynnau PCR meintiol fflwroleuol yn dechnoleg aeddfed iawn.Cyn belled nad ydych chi'n dewis gweithgynhyrchwyr hynod wael, nid yw'r tebygolrwydd o broblemau yn uchel, ond rydym yn dal i fod eisiau rhannu ychydig o bwyntiau gyda chi:
Ensym Taq cychwyn poeth:Y rhan bwysicaf o PCR yw'r ensym Taq cychwyn poeth.Yn gyffredinol, mae'r ensymau cychwyn poeth ar y farchnad yn cael eu rhannu'n ddau fath, mae un yn ensym cychwyn poeth wedi'i addasu'n gemegol (gallwch ei ddychmygu fel mewnosod paraffin), a'r llall yw ensym cychwyn poeth ar gyfer addasu gwrthgyrff (rhwymo antigen-gwrthgyrff).Mae addasu cemegol yn ffordd gynnar o ensymau cychwyn poeth.Pan gyrhaeddir tymheredd penodol, bydd yr ensym yn rhyddhau ei actifedd.Mae'r ensym cychwyn poeth a addaswyd gan wrthgyrff yn defnyddio dulliau biolegol i rwystro gweithgaredd yr ensym.Pan gyrhaeddir tymheredd penodol, bydd y gwrthgorff yn cael ei ddadnatureiddio a'i anactifadu fel protein, a bydd gweithgaredd yr ensym yn cael ei roi ar waith.

Fodd bynnag, beth yw'r defnydd o hyn?Mae hyn yn wir, mae gweithgaredd rhyddhau ensymau a addaswyd gan wrthgyrff yn gyflymach na gweithgaredd ensymau a addaswyd yn gemegol, felly o ran sensitifrwydd, mae gan ensymau a addaswyd gan wrthgyrff fantais fach, fel nad oes unrhyw ensymau a addaswyd yn gemegol yn y pecynnau ar y farchnad yn y bôn.Os oes, yna mae technoleg y gwneuthurwr hwn yn dal i fod yn sownd yn oes y mileniwm.
Crynodiad ïon magnesiwm:Mae crynodiad ïon magnesiwm yn bwysig iawn yn yr adwaith PCR.Gall crynodiad ïon magnesiwm priodol hyrwyddo rhyddhau gweithgaredd ensymau Taq.Os yw'r crynodiad yn rhy isel, bydd gweithgaredd yr ensym yn cael ei leihau'n sylweddol;os yw'r crynodiad yn rhy uchel, bydd yr ymhelaethiad amhenodol wedi'i gatalysio gan ensymau yn cael ei wella.Bydd crynodiad ïonau magnesiwm hefyd yn effeithio ar anelio paent preimio, tymheredd toddi y templed a chynhyrchion PCR, a thrwy hynny effeithio ar gynnyrch darnau chwyddedig.Yn gyffredinol, rheolir crynodiad ïonau magnesiwm ar 25mM.Wrth gwrs, ar gyfer pecyn da, rhaid rheoli crynodiad ïonau magnesiwm yn dda.Mae rhai masnachwyr yn ychwanegu asiant chelating ïon magnesiwm i'r adweithydd, a all gyflawni effaith addasiad awtomatig y crynodiad ïon magnesiwm.
Crynodiad llifyn fflwroleuol:Mae llifyn fflwroleuol, sef y SYBR Green a ddefnyddiwn fel arfer, yn cynhyrchu fflworoleuedd yn bennaf trwy rwymo i'r rhigol leiaf o DNA llinyn dwbl, oherwydd bod rhwymo'r llifyn i DNA llinyn dwbl yn amhenodol, hynny yw Cyn belled â bod DNA llinyn dwbl yn cael ei gyfuno ag ef, gall fflworoleuedd ddigwydd, felly bydd primer-dimers a thempledi yn y system yn cyfuno i ffurfio signal cefndirol â thempledi DNA.
PS: Oherwydd ei briodweddau sy'n sensitif i olau, mae cynhyrchion ar y farchnad yn cael eu pecynnu'n gyffredinol mewn tiwbiau allgyrchol afloyw brown (fel y dangosir yn y llun isod).Fodd bynnag, bydd hyn yn dod ar draws problem.Mae'n anodd gweld a yw'r hylif yn cael ei sugno wrth samplu.Yn hyn o beth, Qingke yn wir yw'r mwyaf hawdd ei ddefnyddio (fel y dangosir yn y llun isod), ac mae'r tiwb tryloyw wedi'i becynnu mewn bag tun afloyw.Yna rhowch ef mewn bag tun, gan ystyried hwylustod osgoi golau a samplu.Rhaid i chi ddewis y rhif cynnyrch cywir.Mae TSE204 yn fodolaeth hynod gost-effeithiol, sy'n gwneud i mi fod eisiau plannu glaswellt.

Mae crynodiad y llifyn fflwroleuol hefyd yn bwysig iawn.Os yw'r crynodiad yn rhy isel, ni fydd y gromlin ymhelaethu yn codi yn ddiweddarach ac nid yw'n berffaith;os yw'r crynodiad yn rhy uchel, bydd yn achosi ymyrraeth sŵn.Gan fod y PCR meintiol fflwroleuol yn dibynnu'n bennaf ar y gwerth CT, os na chaiff crynodiad y llifyn fflwroleuol ei addasu'n iawn, mae'r pwynt isel yn well na'r pwynt uchel.Wrth gwrs, y crynodiad lliw priodol yw'r gorau.

ROX: Defnyddir llifynnau ROX i gywiro gwallau signal fflworoleuedd da-i-ffynnon.Mae rhai gweithgynhyrchwyr offer angen graddnodi, tra nad yw eraill yn gwneud hynny.Er enghraifft, mae'r defnydd o offeryn ymhelaethu PCR Amser Real Thermo Fisher Scientific fel arfer yn gofyn am raddnodi, gan gynnwys 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ac ati. Bydd y cyfarwyddiadau pecyn cyffredinol yn ei ddisgrifio.
Mae Cymysgedd qPCR Foregene hefyd yn cynnwys llifyn ROX, sy'n gyfleus i'w ddefnyddio mewn modelau amrywiol.

Amser Real PCR Kit-Taqman

Triniaeth bond hydrogen gwan: Mae trin bondiau hydrogen gwan yn fater cymharol dechnegol.Nid oes dim wedi darllen llawlyfrau llawer o gitiau, ond ni soniodd yr un ohonynt am y pwnc hwn.Mewn gwirionedd, mae mor bwysig.Mae'r cyfuniad o fasau yn dibynnu'n bennaf ar gryfder bondiau hydrogen.Mae bondiau hydrogen cryf yn ymhelaethiad arferol, ac mae bondiau hydrogen gwan yn arwain at ymhelaethu amhenodol.Os na ellir dileu bondiau hydrogen gwan yn dda, ni ellir osgoi ymhelaethu amhenodol.O fewn cwmpas yr awdur, dim ond ychydig o gwmnïau sydd wedi sylwi ar y broblem hon.Pan fyddwch yn prynu'r cit, gallwch gyfeirio at a ydych wedi ystyried ateb yn hyn o beth ar gyfer y cit yr ydych am ei ddewis.

Cyfaint adwaith: Mae'r system 20-50ul yn cael ei ddefnyddio'n fwy cyffredin, ac mae cyfeintiau llai yn debygol o achosi gwallau.Yn gyffredinol, bydd cyfarwyddiadau'r pecyn yn argymell defnyddio cyfeintiau adwaith PCR.Peidiwch â bod yn graff a defnyddiwch gyfeintiau llai i arbed costau.y nod o.Mae'r cyfaint a argymhellir gan y masnachwyr wedi'i brofi mewn gwirionedd, ac efallai na allant ddatrys problem gwallau a achosir gan gyfeintiau bach.
2. Y gwneuthurwr a rhif erthygl y plât tiwb
Mae pawb yn gwybod egwyddor PCR meintiol fflwroleuol.Mae casglu fflworoleuedd yn cael ei wneud yn bennaf trwy gapiau tiwb PCR.Wrth ddewis nwyddau traul PCR, rhowch sylw i ddau bwynt: trosglwyddiad golau da ac yn addas ar gyfer yr offeryn.Yn gyffredinol, mae byrddau a thiwbiau brandiau prif ffrwd yn iawn, ond mae'n rhaid i chi ddewis yn ofalus o ran addasu, fel arall ni fyddwch yn gallu defnyddio'r offeryn.

4. Gwybodaeth lefel uchaf

MIQE (8) — dilysiad qPCR
Dyma brif flaenoriaeth qPCR!Mae cymaint o arwyr wedi syrthio i'r tywod yma.Wrth gwrs, mae hefyd yn bosibl eich bod chi'n lwcus ac mae'r genynnau a astudiwyd gennych yn syml, felly fe wnaethoch chi arnofio trwy'r ogof iâ ar hyd y gwynt.Bwriad gwybodaeth ddilysu qPCR yw profi dibynadwyedd y data.Rydym yn rhestru'r wybodaeth ddilysu angenrheidiol fel a ganlyn:

Prawf 1.Specificity
Mae penodoldeb ymhelaethu genynnau targed yn cael ei brofi trwy wirio a yw'r llun electrofforesis yn un band;dilysu dilyniannu;cromlin doddi i weld a yw'r map brig yn sengl;gwirio treuliad ensymau a dulliau eraill.
Yma, rydym yn canolbwyntio ar tdadansoddiad o ymhelaethu amhenodol gan ddefnyddio'r dull o doddi cromliniau.A siarad yn gyffredinol, pan fyddwn yn dylunio paent preimio, mae'n ofynnol i faint y darn cynnyrch fod yn yr ystod o 80-200bp, sy'n gwneud tymheredd toddi y cynnyrch PCR ystod 80-85 ° C.Felly, os oes brigau amrywiol, rhaid bod cynhyrchion ymhelaethu amhenodol eraill;os yw'r brig yn ymddangos yn is na 80 ° C, ystyrir yn gyffredinol ei fod yn dimer preimio;os yw'r brig yn ymddangos yn uwch na 85°C, ystyrir yn gyffredinol ei fod yn halogiad DNA neu'n fwy Amhenodol ymhelaethu ar ddarnau mawr.
Sylwer: Weithiau dim ond un brig sydd ar 80°C.Ar yr adeg hon, rhaid cadw at y cysyniad hwn.Mae'n debygol bod y canlyniadau ymhelaethu i gyd yn dimers paent preimio.

Cromlin toddi arferol (uchafbwynt sengl heb unrhyw ymhelaethiad amhenodol)

Cromlin doddi broblemus (ymhelaethiad amhenodol ar gopaon ysbeidiol)
【Dadansoddiad achos】

Mae yna brif frig, ond mae'r dimer primer yn ddifrifol
Gall y gromlin toddi un brig yn y ffigur isod dwyllo'ch llygaid yn hawdd, gan feddwl ei fod yn arbrawf perffaith, ond mae'r canlyniad yn gwbl anghywir.Ar yr adeg hon, mae'n rhaid inni edrych ar y tymheredd toddi.Mae'r tymheredd brig yn is na 80 ° C, sy'n gwbl primer-dimer.

Dim darn targed, pob dimers paent preimio
Yma, ni all fy mrawd stopio.Mae'r llun isod yn llun a dynnwyd gyda ffôn symudol a anfonwyd ataf gan scumbag.Mae'r adweithyddion a ddefnyddiodd i gyd yn frandiau a ddefnyddir yn gyffredin yn y diwydiant.Newidiodd o un brand rhagddodiad T i frand T-prefix arall.Rwy'n meddwl eich bod eisoes wedi ei ddyfalu.Gwaeddodd y scumbag arnaf: “Mae'r adweithydd a ddefnyddiwyd yn y llun cyntaf yn rhy dda, ac mae'r brig yn sengl.Yn ddiweddarach, ar ôl defnyddio'r adweithydd a argymhellwyd gennych, mae'n dod yn debyg i'r ail lun, gyda chopaon cymysg.Rydych chi wedi fy ngwneud i'n ddiflas.“
Gwahanwch y ddau graff.Ar yr olwg gyntaf, mae gan un uchafbwynt sengl, ac mae gan y llall uchafbwynt dwbl.Nonsens, mae un brig yn iawn wrth gwrs.Ydy hynny'n wir?
Yn waeth na Dou E, os byddaf yn rhoi'r ddau lun yn y llun isod, byddwch yn deall ar unwaith.Yn wir, rydym yn cael ein parlysu'n hawdd gan y math hwn o lun.Ar ôl dadansoddiad gofalus, canfuwyd: bod uchafbwynt y ffigur cyntaf ar 75°C, sef dimer paent preimio llwyr;mae brig yr ail ffigur yn ymddangos ar 75 ° C a 82 ° C, o leiaf mae Mae'r cynnyrch yn ymddangos.

Lluniau o adborth gan fyfyrwyr
Felly nid problem adweithyddion yw'r broblem sylfaenol, ond problem dylunio paent preimio.Ar yr un pryd, mae hefyd yn profi nad yw rhai brandiau mawr o ansawdd haearn, ac mae hefyd yn profi'r hyn a ddywedodd fy mrawd o'r blaen: Nid y brand adweithydd sy'n cefnogi'ch erthygl.Eich erthygl chi a gynhaliodd frand yr adweithyddion.Dychmygwch, pe na bai'r scumbag yn newid yr adweithyddion, byddai'r data anghywir yn cael ei anfon i'r cyfnodolyn, a byddai'r hyn a fyddai'n digwydd yn drasiedi.
2. Ct gwerth rheolaeth wag
Peidiwch ag esbonio, os oes gan y rheolaeth wag werth Ct, onid llygredd?Fodd bynnag, mae angen i chi ddeall o hyd pa reolaeth wag sydd â gwerth Ct.Os yw'n NTC, mae'n golygu bod DNA tramor fel halogiad adweithydd.Os yw'n NRT, mae'n golygu bod gan yr RNA a echdynnwyd halogiad DNA.
3. cromlin safonol
Gan gynnwys y fformiwla llethr a chyfrifo, gellir cyfrifo'r effeithlonrwydd PCR trwy'r fformiwla.Mae arbrawf perffaith yn gofyn bod llethr y gromlin safonol yn nesáu at 3.32, ac R² i nesáu at 0.9999.
4. Amrediad deinamig llinol
Mae amrediad deinamig yr adwaith yn llinol.Yn ôl y templed a ddefnyddir i gynhyrchu'r gromlin safonol, dylai'r ystod ddeinamig gynnwys o leiaf 5 graddiant crynodiad, a rhoi sylw i newid gwerthoedd Ct ar raddiannau crynodiad uchel a graddiannau crynodiad isel.
5. Cywirdeb canfod
Mae newidiadau mewn canlyniadau qPCR, hynny yw, ailadroddadwyedd gwael, hynny yw, cywirdeb gwael, yn cael eu hachosi gan lawer o ffactorau, gan gynnwys tymheredd, crynodiad a gweithrediad.Yn gyffredinol, mae trachywiredd qPCR yn dod yn llai rheoladwy wrth i nifer y copi ostwng.Yn ddelfrydol, o fewn amrywiad arbrofol, dylai'r amrywiad technegol hwn fod yn wahanol i amrywiad biolegol, a gall atgynyrchiadau biolegol fynd i'r afael yn uniongyrchol â gwahaniaethau ystadegol mewn canlyniadau qPCR rhwng grwpiau neu driniaethau.Yn benodol ar gyfer profion diagnostig, mae'n rhaid adrodd ar y trachywiredd rhyng-assay gorau (y gallu i'w hailadrodd) ar draws safleoedd a gweithredwyr.
6. Effeithlonrwydd canfod a LOD (mewn amlblecs qPCR)
LOD yw'r crynodiad isaf o 95% o samplau positif a ganfuwyd.Mewn geiriau eraill, ni ddylai'r crynodiad o LOD a gynhwysir o fewn set o atgynyrchiadau genyn targed fod yn fwy na 5% o'r adweithiau a fethwyd.Wrth wneud dadansoddiad qPCR amlblecs, yn enwedig ar gyfer canfod treigladau pwynt neu polymorphisms ar yr un pryd, mae angen i qPCR amlblecs ddarparu tystiolaeth nad yw cywirdeb darnau targed lluosog yn cael ei beryglu yn yr un tiwb, canfod lluosog a chanfod tiwb sengl Dylai Effeithlonrwydd a LOD fod yr un peth.Yn enwedig pan fydd genynnau targed crynodiad uchel a genynnau targed crynodiad isel yn cael eu chwyddo ar yr un pryd, rhaid talu sylw i'r broblem hon.
Problemau ac atebionYn gyffredinol, mae'r problemau a wynebir yn aml wrth ddadfygio qPCR yn canolbwyntio ar yr agweddau canlynol:
· ymhelaethu amhenodol
·Dewis anodd o ganolbwyntio paent preimio a thrafferth gyda dimers paent preimio
· Mae'r tymheredd anelio yn anghywir
· Mae strwythur eilaidd yn effeithio ar effeithlonrwydd ymhelaethu
ymhelaethu amhenodol
ymhelaethu amhenodolyn digwydd, ystyrir yn gyffredinol a yw'r dyluniad paent preimio yn anaddas, ond os nad ydych chi ar frys i newid y paent preimio, gallwch chi roi cynnig ar y dulliau canlynol yn gyntaf (mae'r egwyddor hefyd ynghlwm):
·Cynyddwch y tymheredd anelio – ceisiwch wneud bondiau hydrogen gwan yn methu â chynnal;
·Cyrhau amser anelio ac ymestyn – lleihau'r siawns o fondiau hydrogen gwan;
·Lleihau crynodiad preimio – lleihau'r siawns o rwymo paent preimio segur a rhanbarthau nad ydynt yn darged;
Effeithlonrwydd ymhelaethu isel
Mae’r sefyllfa i’r gwrthwyneb i ymhelaethu amhenodol – effeithlonrwydd ymhelaethu isel , a’r mesurau i ymdrin ag effeithlonrwydd ymhelaethu isel i’r gwrthwyneb yn unig:
·Ymestyn yr amser anelio ac ymestyn;
· Newid i PCR tri cham a lleihau'r tymheredd anelio;
·Cynyddu'r crynodiad preimio;
Ps: Mae llawer o fyfyrwyr graddedig a aned yn y 90au yn anfodlon astudio sut i ddadfygio arbrofion, ac yn gobeithio y gall y pecyn ddatrys y broblem yn llwyr (os ydych chi am fynd i gwmni adweithydd i wneud ymchwil a datblygu ar ôl graddio), mewn gwirionedd, mae'r gwneuthurwyr adweithyddion hefyd yn meddwl fel hyn, rwy'n gobeithio ei fod yn ffwl. ffactorau orption.Er mwyn datrys y broblem yn hawdd, mae ffyliaid yn dal i orfod darllen cyflwyniad y cwmni adweithydd i weld a oes ffactor sy'n amsugno bondiau hydrogen gwan.
Dewis anodd o ganolbwyntio paent preimio a thrafferth gyda dimers paent preimio
Dull 1: Yn gyffredinol, mae'r cyfarwyddiadau pecyn ar gyfer qPCR wedi argymell systemau a chrynodiadau paent preimio a argymhellir.
Dull 2: Dadfygio trwy osod graddiant crynodiad y paent preimio.Mae'r llun isod wedi'i ddwyn o gwmni i'w ddarlunio.Mae'r ffigur isod yn dangos y canlyniadau meintiol fflworoleuedd a wnaed gyda thri graddiant crynodiad preimio (100nM, 250nM, 500nM) a phedwar graddiant crynodiad templed (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Mae gwerth Ct y canlyniadau arbrofol wedi'i blotio fel a ganlyn:

Dethol Crynodiad Primer Cydgadwynwch bob crynodiad preimio i linell fel a ganlyn:

Mae'r dewis o grynodiad paent preimio yn amlwg, mae perthynas linellol y crynodiad primer o 100nM a 250nM yn well, ac mae perthynas linellol y crynodiad preimio o 500nM yn gymharol wael.Yn 100nM a 250nM, mae gwerth Ct o 250nM yn gymharol fach, felly y crynodiad preimiwr gorau posibl yw 250nM.Yn gyffredinol, gellir gweld paent preimio difrifol yn y gromlin doddi.Beth os na all y paent preimio a ddyluniwyd osgoi paent preimio?
Dull 3: Lleihau faint o preimio a chynyddu'r tymheredd anelio (nid oes angen esbonio).
Gwerth empirig y tymheredd anelio yw 60 ° C.Os nad ydych yn siŵr, sut i ddewis tymheredd anelio mwy addas?Mae'r ateb yr un peth â'r dewis o grynodiad paent preimio -prawf graddiant.Tynnwch lun gan gwmni Bio-rad i ddangos y broblem.Ar gyfer ymhelaethu ar ddarn targed penodol, gosodwch wyth graddiant tymheredd, pob un â thri ailadroddiad, ac mae'r gromlin ymhelaethu a gafwyd fel a ganlyn:

dewis tymheredd anelio:
·70°C, 69°C — Yn y bôn, ni ellir cyfuno'r paent preimio, felly nid oes unrhyw ymhelaethu.
·67.3°C – Mae ychydig bach o ymhelaethu ar y dechrau, ac mae'r gwerth Ct yn gymharol fawr.
·64.5°C —— Mae gwerth Ct yn gostwng.
· Ar 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, a 55.0°C, roedd y gwerthoedd Ct yn y bôn yn tueddu i fod yn sefydlog, ond roedd y gwerthoedd fflworoleuedd terfynol yn wahanol.
Sut i ddewis?Egwyddor: Yr egwyddor gyntaf yw'r gwerth Ct uwch.Ar gyfer yr un gwerth Ct, dewiswch dymheredd anelio uwch er mwyn osgoi dimerization ac ymhelaethu amhenodol.Er bod gwerth fflworoleuedd uwch ar 55°C, gall fod pylu neu ymhelaethu amhenodol ynddo.
Ond os ydych chi mor smart â chi, byddwch yn bendant yn meddwl: Yn rhesymegol, os yw'r adwaith PCR yn benodol iawn, cyn belled â bod y crynodiad preimio yn fwy na'r gofyniad lleiaf, ni ddylai'r pwyntiau uchel ac isel gael unrhyw effaith, yn union fel llifynnau fflwroleuol a dNTPs.Yn wir, cyn belled â bod y tymheredd anelio wedi'i optimeiddio'n iawn, bydd effaith crynodiad preimio ar werth Ct yn naturiol yn cael ei leihau.

Mae'r tymheredd anelio wedi'i optimeiddio'n iawn, a bydd effaith crynodiad paent preimio ar CT yn cael ei leihau
Mae strwythur eilaidd yn effeithio ar effeithlonrwydd ymhelaethu
Gadewch i ni dynnu'r llun o Bio-rad i ddangos y broblem.Mae hefyd yn dylunio graddiant tymheredd i chwyddo genyn â strwythur eilaidd.

Strwythur eilaidd yn dod i'r amlwg
Gellir gweld, wrth i'r graddiant tymheredd ostwng, bod cynhyrchion yn dechrau ymddangos a'r gwerth Ct yn symud ymlaen, gan gyrraedd y gwerth lleiaf ar 60.7 ° C, ac yna wrth i'r graddiant tymheredd ostwng, mae'r gwerth Ct yn dod yn fwy.I'r gwrthwyneb, wrth i'r tymheredd gynyddu, mae'r strwythur eilaidd yn agor ac mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn cynyddu.Ar ôl cyrraedd tymheredd penodol, ni all cynyddu'r tymheredd wella'r effeithlonrwydd ymhelaethu.Oherwydd ni ellir cyfuno'r paent preimio yn sefydlog ar hyn o bryd.Felly,edrychwch am y tymheredd gyda'r gwerth Ct isaf, sef y tymheredd gorau ar gyfer ymhelaethu ar y templed strwythur uwchradd!Wrth gwrs, mae'n rhaid i ffyliaid smart wybod, os nad oes angen, mae'n well newid y paent preimio ac osgoi'r rhanbarth strwythur uwchradd.
5. Lefel cais
MIQE - Dadansoddi Data

Rhoddir y dadansoddiad data yn bennaf gan yr offeryn PCR meintiol fflwroleuol.Yn yr erthygl flaenorol, mae llawer o waith dadansoddi data wedi'i wneud, megis y rheolaeth wag, sydd wedi'i esbonio yn nyluniad yr arbrawf.Mae'r genynnau cyfeirio mewnol, rhifau ailadrodd, ac ati wedi'u hegluro., yma rydym yn esbonio cymhwysiad qPCR yn bennaf.
Defnyddir qPCR yn eang, a gwirio arbrofol a diagnosis asid niwclëig yw'r senarios a ddefnyddir amlaf.
meintioli absoliwt
Mae gan log (crynodiad cychwynnol) berthynas llinol â nifer y cylchoedd.Gellir tynnu cromlin safonol o safon gyda rhif copi cychwynnol hysbys, hynny yw, gellir cael perthynas linellol yr adwaith mwyhau.Yn ôl gwerth Ct y sampl, gellir cyfrifo'r crynodiad yn y sampl.Swm y templedi i'w cynnwys.

Dull Cyfrifo Meintiol Absoliwt
Rhaid i feintioli absoliwt fod yn seiliedig ar y gromlin safonol.I wneud cromlin safonol, mae angen safon.Fel arfer, y safon yw plasmid a geir trwy glonio'r genyn targed.Pam ei fod yn blasmid?Oherwydd mai DNA plasmid crwn yw'r mwyaf sefydlog.Gwanhau'r cynnyrch safonol mewn 5 i 6 graddiant yn ôl y gymhareb dyblu (gwanhau 10-plyg), a rhoi sylw i'r unffurfiaeth wrth wanhau.Gadewch i'r gwerth Ct ostwng rhwng 15-30.

Paratoi safonol
Ar yr un pryd, dylai'r sampl sydd i'w brofi hefyd gael ei wanhau yn unol â hynny (cofiwch y ffactor gwanhau), a dylai'r gwerth Ct hefyd ostwng rhwng 15-30.Mae'r cynnyrch safonol + y sampl i'w brofi yn cael eu rhoi ar y peiriant gyda'i gilydd.Ar ôl y rhediad, gwnaed cromlin safonol gyda'r sylwedd safonol, a daethpwyd â'r samplau i'w profi i'r gromlin safonol i gyfrifo'r crynodiad.
Mae meintioliad firws Hepatitis B HBV yn fesuriad absoliwt nodweddiadol, sy'n gallu cyfrifo rhif copi firws mewn 1ml o waed.
Cyfrifo rhif copi
Crynodiad sampl i'w brofi (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × ffactor gwanhau
Pwysau moleciwlaidd enghreifftiol = nifer y basau × 324
Rhif copi y sampl i'w brofi (copïau/ul) = crynodiad y sampl i'w brofi / pwysau moleciwlaidd y sampl × 6 × 1014

Dull cyfrifo rhif copi

Yr uchod yw'r dull cyfrifo ar gyfer pennu maint.Mae hon yn broblem fathemategol y gellir ei datrys ar ôl graddio o'r ysgol uwchradd iau, ac yn gyffredinol mae problemau mathemategol yn cael eu datrys gan gyfrifiaduron.Os nad ydych chi'n deall, gallwch chi ddod i gyfathrebu.
meintioli cymharol
Defnyddir meintioli cymharol yn bennaf mewn ymchwil wyddonol.Faint o firysau sydd mewn 1ml o waed, ac mae'n firws DNA, mae hwn yn ddigwyddiad cymharol benderfynol: gellir pennu faint o waed, ac mae'r firws DNA yn gymharol sefydlog.Fodd bynnag, mae'n anodd inni gymharu nifer y copïau trawsgrifio o enyn penodol mewn deilen, oherwydd ei bod yn anodd pennu maint, pwysau a thynerwch y ddeilen, mae'n anodd pennu faint o RNA a echdynnwyd, ac mae effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro hefyd yn anodd ei bennu, hynny yw, gall unrhyw gam wneud i'r data arbrofol fod â chwilod ac ni ellir ei ddefnyddio.
Felly, rhaid i feintoli cymharol gyflwyno elfen:y genyn cyfeirio mewnol .
Mewn geiriau eraill, mae meintioli cymharol mewn gwirionedd yn gymhariaeth rhwng y genyn targed a'r genyn cyfeirio mewnol.O'i gymharu yn yr un meinwe a'r un gell, mae dylanwad maint sampl, swm echdynnu RNA, effeithlonrwydd trawsgrifio gwrthdro, ac effeithlonrwydd PCR yn gymharol fach.Oherwydd maint bach y sampl, cafodd genynnau cyfeirio mewnol a genynnau targed eu lleihau'n gymharol.Dyma pam yr ydym wedi bod yn pwysleisio unffurfiaeth a sefydlogrwydd o’r blaen.
Mae genynnau cyfeirio mewnol yn gyffredinolgenau cadw ty(genynnau cadw tŷ), sy'n cyfeirio at ddosbarth o enynnau a fynegir yn sefydlog ym mhob cell, ac mae eu cynhyrchion yn angenrheidiol i gynnal gweithgareddau bywyd sylfaenol celloedd.
Peidiwch â drysu'r cysyniad hwn.Termau swyddogaeth fiolegol yw genynnau cadw tŷ, tra bod genynnau cyfeirio mewnol yn dermau technegol arbrofol.Mae angen i enynnau cadw tŷ basio dilysiad cyn y gellir eu dewis fel genynnau cyfeirio mewnol.
Er enghraifft, dewisom sawl genyn cadw tŷ yn y ffigur isod i brofi eu lefelau mynegiant mewn gwahanol gelloedd meinwe, a chanfuwyd bod lefelau mynegiant β-2-microglobwlin yn dra gwahanol i rai'r tri genyn arall, felly ni ellid eu defnyddio fel genynnau cyfeirio mewnol.

Ar ôl deall swyddogaeth cywiro'r genyn cyfeirio mewnol, mae dau algorithm yn deillio o ganlyniad i gyflwyno'r genyn cyfeirio mewnol.
·dull cromlin safonol dwbl
·2 – △△ Dull Ct (dull cymharu gwerth CT)
Os oes gennych ddiddordeb mewn astudio rhywogaethau a swyddogaethau genynnau, rhowch y gorau i'r ymchwil ar algorithmau a defnyddio fformiwlâu yn uniongyrchol, neu ddefnyddio peiriannau yn uniongyrchol;os ydych chi'n ddyn syth mewn mathemateg a pheirianneg, mae croeso i chi.
dull cromlin safonol dwbl
Mesur genyn targed a genyn cadw tŷ y sampl rheoli a'r sampl i'w brofi trwy'r gromlin safonol, ac yna cyfrifwch y gwerth cymharol yn ôl y fformiwla gyfrifo, sef y lefel mynegiant cymharol.
Manteision: dadansoddiad syml, optimeiddio arbrofol cymharol syml
Anfantais: Ar gyfer pob genyn, rhaid i bob rownd o arbrofion wneud cromlin safonol
Cais: Un o'r ddau ddull meintiol cymharol mwyaf cyffredin a ddefnyddir ac a gydnabyddir wrth astudio rheoleiddio mynegiant genynnau
Mae'r fformiwla fel a ganlyn:

Mae enghreifftiau fel a ganlyn:

Cyfrifwch y swm cymharol yn seiliedig ar y canlyniad meintiol
2 - △△ Dull Ct (dull cymharu gwerth CT)

Manteision: Nid oes angen gwneud cromlin safonol
Anfanteision: Tybir bod yr effeithlonrwydd ymhelaethu yn agos at 100%;mae'r gwyriad safonol yn <5%, a thybir bod y gromlin safonol a'r effeithlonrwydd rhwng pob ymhelaethiad yn gyson;mae optimeiddio amodau arbrofol yn fwy cymhleth.
Cais: Un o'r ddau ddull meintiol cymharol mwyaf cyffredin a ddefnyddir ac a gydnabyddir wrth astudio rheoleiddio mynegiant genynnau

Wrth gwrs, mae'r effeithlonrwydd ymhelaethu fel arfer yn amhosibl i fod yn berffaith 1. Dull cywiro: Os ydym yn gwybod bod gan y genyn targed a'r genyn cyfeirio yr un effeithlonrwydd ymhelaethu, ond nid yw'r effeithlonrwydd ymhelaethu yn hafal i 1, yna gellir cywiro 2－△△Ct fel: (1+E)－△△Ct, er enghraifft, gellir cywiro'r cyfrifiad effeithlonrwydd i 0.9, er enghraifft, os gellir cywiro'r cyfrifiad effeithlonrwydd i 0.9. 5－△△Ct
Hyd yn hyn, mae'r cynnwys am PCR meintiol fflwroleuol wedi dod i ben.